Наши услуги
О нас
Доклинические исследования
Регламент
Видео доклинические исследования
Клинические исследования
Регламент
Клинические исследования видео
Набор добровольцев
Архив исследований
Набор пациентов
Новости медицины
Интервью
Архив новостей
Контакты
Вакансии
НАВЕРХ

Регламент

S2(R1) Руководство по испытаниям генотоксичности и интерпретация данных в отношении лекарственных средств, предназначенных для человека

МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ ПО ГАРМОНИЗАЦИИ ТЕХНИЧЕСКИХ ТРЕБОВАНИЙ К РЕГИСТРАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА

Гармонизированное трехстороннее руководство ICH


Руководство по испытаниям генотоксичности и интерпретация данных в отношении лекарственных средств, предназначенных для человека


S2(R1)


Действующая версия 4 этапа


от 9 ноября 2011 г.


Данное Руководство было разработано соответствующей Экспертной рабочей группой ICH, оно было представлено на рассмотрение регуляторным органам в рамках процесса ICH. На 4 этапе процесса финальный проект рекомендован для принятия регуляторными органами Европейского Союза, Японии и США.

S2(R1)
История документа











Код История Дата

S2A:
Руководство по специфическим аспектам регистрационных испытаний генотоксичности лекарственных средств
















S2A Одобрение Руководящим комитетом в рамках 2 этапа и вынесение на общественное обсуждение. 10 марта 1994 г.
S2A Одобрение Руководящим комитетом в рамках 4 этапа и рекомендация к принятию тремя регуляторными органами ICH. 19 июля 1995 г.

S2B:
Генотоксичность: стандартная батарея тестов генотоксичности лекарственных средств
















S2B Одобрение Руководящим комитетом в рамках 2 этапа и вынесение на общественное обсуждение. 2 октября 1996 г.
S2B Одобрение Руководящим комитетом в рамках 4 этапа и рекомендация к принятию тремя регуляторными органами ICH. 16 июля 1997 г.

S2(R1):
Пересмотр руководств S
2A и S2B, объединенных по итогам анализа











S2(R1) Одобрение Руководящим комитетом S2(R1) в рамках 2 этапа и вынесение на общественное обсуждение. 6 марта 2008 г.

Текущая версия в рамках 4 этапа











S2(R1) Одобрение Руководящим комитетом S2(R1) в рамках 4 этапа и рекомендация к принятию тремя регуляторными органами ICH. 9 ноября 2011 г.

Руководство по испытаниям генотоксичности и интерпретация данных в отношении лекарственных средств, предназначенных для человека


Гармонизированное трехстороннее руководство ICH


По достижении 4 этапа процесса ICH в рамках встречи Руководящего комитета ICH 09 ноября 2011 г., данное руководство рекомендовано к принятию тремя регуляторными органами ICH

 

Руководство по испытаниям генотоксичности и интерпретация данных в отношении лекарственных средств, предназначенных для человека


1. Введение

1.1 Цели руководства

Данное руководство заменяет и объединяет руководства ICH S2A и S2B. Цель пересмотра заключается в оптимизации стандартной батареи испытаний генотоксичности с целью предсказания потенциального риска для человека и представления руководства по интерпретации результатов с конечной целью совершенствования оценки риска канцерогенных эффектов, основанных на изменении генетического материала. В пересмотренном руководстве описаны согласованные на международном уровне стандарты испытаний и интерпретация положительных результатов in vitro и in vivo в рамках стандартной батареи тестов генотоксичности, включая оценку нерелевантных результатов. Данное руководство охватывает только лекарственные средства, предназначенные для человека.

1.2 Справочная информация

В учет принимались актуальные рекомендации последнего руководства Организации экономического сотрудничества и развития (OECD) и отчеты Международных семинаров по испытаниям генотоксичности (IWGT). В некоторых случаях имелись различия между рекомендациями OECD или IWGT, перечисленные в тексте. В контексте других руководств ICH следует применять следующие примечания к руководству.

1.3 Область применения руководства

Данное руководство создано в целях испытания новых «низкомолекулярных» лекарственных веществ, и не распространяется на биологические препараты. Рекомендации относительно времени проведения исследований в рамках клинической разработки представлены в руководстве ICH M3 (R2).

1.4 Общие принципы

К испытаниям генотоксичности относятся тесты, проводимые in vitro и in vivo в целях выявления компонентов, индуцирующих генетическое повреждение вследствие различных механизмов. Данные испытания позволяют определить риск в отношении повреждения ДНК и фиксации. Фиксация повреждения ДНК в форме генных мутаций, более обширные хромосомные повреждения или рекомбинация, в целом необходимая для наследуемых эффектов и в рамках многоэтапного процесса развития злокачественного новообразования – сложного процесса, в рамках которого генетические изменения, возможно, играют роль лишь частично. Числовые хромосомные изменения также были обусловлены туморогенезом и могут указывать на возможную анеуплоидию в зародышевых клетках. Вещества, дающие положительный результатов в испытаниях по определению подобных нарушений могут иметь канцерогенный и/или мутагенный потенциал для человека. Поскольку связь между концентрацией определенных препаратов и канцерогенезом установлена для человека, в то время как подобную связь трудно доказать для наследственных болезней, испытания генотоксичности применялись, главным образом, для установления канцерогенности. Несмотря на это, поскольку мутации зародышевой линии имеют четкую связь с заболеванием у человека, подозрение на то, что лекарственное вещество может провоцировать наследственные эффекты, считается не менее серьезным, чем подозрение на канцерогенные эффекты вещества. Кроме того, результаты исследований генотоксичности имеют большое значение для интерпретации исследований канцерогенности.

2. Стандартная батарея тестов для оценки генотоксичности

2.1 Обоснование

Регистрация лекарственных средств требует полноценной оценки генотоксического потенциала. Обширный анализ показал, что многие вещества, показавшие свойства мутагенности при проведении теста Эймса на обратную мутацию бактерий являются канцерогенами для грызунов. Кроме того, испытания на тканях млекопитающих in vitro повышают чувствительность к детекции канцерогенов у грызунов и расширяют спектр выявляемых генетических нарушений, при этом снижая специфичность определения, т.е. повышают частоту положительных результатов, что не коррелирует с данными о канцерогенности у грызунов. Кроме того, использование батарей тестов целесообразно, поскольку ни один тест отдельно не способен выявить все генотоксические механизмы развития туморогенеза.

Общие характеристики стандартной батареи тестов:

i. Оценка мутагенности в виде теста обратной мутации бактерий. Данный тест позволяет выявить соответствующие генетические изменения и большинство канцерогенов человека и грызунов с генотоксическим потенциалом.

ii. Генотоксичность также следует оценивать в клетках млекопитающих in vitro и/или in vivo следующим образом.

Несколько систем анализа клеток млекопитающих in vitro широко используются и могут считаться в достаточной степени валидированными. Анализ хромосомных аберраций в метафазе in vitro, микроядерные пробы in vitro (Примечание 1) и анализ генных мутаций клеток лимфомы мышей L5178Y Tk (тимидинкиназы) (MLA). Данные три анализа в настоящее время считают в одинаковой степени актуальными, а следовательно, и взаимозаменяемыми при анализе повреждения хромосом при использовании в сочетании с другими испытаниями генотоксичности в рамках стандартной батареи тестов лекарственных средств, в случае если используются протоколы испытаний, представленных в Руководстве.

Испытания in vivo включены в батарею тестов, поскольку некоторые вещества показывают мутагенность in vivo, но не in vitro (Примечание 2) а также потому, что желательно включить анализы, учитывающие такие факторы как всасывание, распределение, метаболизм и выведение. По данной причине также проведен выбор анализа микрочастиц в эритроцитах (в крови и костном мозге) или хромосомных аберраций в клетках костного мозга в метафазе (Примечание 3). Лимфоциты, культивируемые от животных, получавших лечение, также могут использоваться для цитогенетического анализа, несмотря на ограниченный опыт проведения подобного анализа.

Испытания in vitro и in vivo для оценки хромосомных аберраций клеток в метафазе выявляют широкий спектр нарушений хромосомной целостности. Поломка хроматид или хромосом может привести к формированию микроядер в случае образования ацентрического фрагмента, поэтому анализы, позволяющие определить хромосомные аберрации или микроядра подходят для выявления кластогенов. Микроядра могут образоваться вследствие задержки одной или нескольких цельных хромосом в анафазе, поэтому микроядерные пробы потенциально позволяют определить некоторые индукторы анеуплоидии. MLA позволяет выявить мутации гена Tk , обусловленные генными мутациями и хромосомными повреждениями. Имеются сведения о том, что при помощи MLA также возможно выявить утрату хромосом.

Существуют некоторые дополнительные анализы in vivo, которые можно использовать в рамках батареи тестов или в качестве дополнительных тестов для получения необходимого объема доказательств при оценке результатов анализов in vitro и in vivo (см. ниже). Отрицательных результатов соответствующих анализов in vivo (обычно двух) с достаточным обоснованием конечных точек и демонстрацией концентраций (см. Раздел 4.4) обычно оказывается достаточно для подтверждения отсутствия существенного риска генотоксичности.

2.2 Описание двух вариантов стандартной батареи тестов

Следующие два варианта стандартной батареи тестов считаются в равной степени приемлемыми (Примечание 4):

Вариант 1

i. Испытание генных мутаций в бактериях.

ii. Цитогенетический тест хромосомных повреждений (анализ хромосомных аберраций в метафазе in vitro или микроядерная проба in vitro) либо анализ генных мутаций Tk в лимфоме мышей in vitro

iii. Тест генотоксичности in vivo, обычно тест на хромосомные поломки на гемопоэтических клетках мышей в виде либо микроядерной пробы либо анализа на хромосомные аберрации в метафазе.

Вариант 2

i. Испытание генных мутаций в бактериях.

ii. Оценка генотоксичности in vivo двух разных тканей, обычно микроядерная проба с использованием гемопоэтических клеток грызунов и второй анализ in vivo. Как правило, используется анализ поломки нитей ДНК в печени, если не указано иного (см. Ниже, раздел2. и Примечание 12).

Исторически опыт выбора Варианта 1 шире, отчасти потому что он основан на версии S2A и B. Однако аргументами в пользу взаимозаменяемости вариантов 1 и 2 включают: при получении положительного результата анализа на клетках млекопитающих in vitro, четкие отрицательные результаты двух проведенных анализов in vivo в соответствующих тканях при подтвержденной достаточной концентрации считаются достаточными для подтверждения отсутствия генотоксического потенциала in vivo (см. Раздел 5.4.1.1 ниже). Таким образом, стратегия проведения анализа, при которой проводятся два анализа in vivo, аналогична стратегии контроля положительного результата in vitro (Примечание 4).

При проведении испытаний в разных вариантах может использоваться дизайн исследований in vivo острой или хронической токсичности. При многократном введении предпринимались попытки включить конечные точки генотоксичности в исследования токсичности, с учетом научной обоснованности. При оценке in vivo нескольких конечных точек предпочтительнее включать их в одно исследование. Зачастую имеется достаточно информации о вероятной пригодности доз в рамках исследования длительной токсичности до начала исследования, позволяющих определить целесообразность проведения острого теста или комплексного испытания.

В случае получения отрицательных результатов использование одного из вариантов стандартной батареи тестов, проводимых и оцениваемых в соответствии с текущими рекомендациями, обеспечит достаточные доказательства отсутствия генотоксической активности и в этом случае дополнительных тестов не требуется. В случае получения положительных результатов стандартной батареи тестов в зависимости от их терапевтической пользы, вещество подлежит более тщательному исследованию (см. Раздел 5).

Несколько анализов in vivo могут быть использованы во второй части оценки in vivo в рамках Варианта 2 (см. Раздел 4.2), некоторые из которых могут быть интегрированы в исследования токсичности многократных доз. Предпочтительной тканью является печень, благодаря характеристикам достигаемых концентраций и метаболизма, но выбор ткани для анализов in vivo и видов анализов должен быть основан на понимании потенциального механизма метаболизма in vivo или тканей, подверженных воздействию.

Информацию о числовых изменениях можно получить в результате анализов на клетках млекопитающих in vitro и микроядерных проб in vitro или in vivo. Элементы стандартных протоколов, способные указывать на подобный потенциал, включают повышение митотического индекса, индукцию полиплоидии и микроядерную оценку.  Также имеются экспериментальные доказательства того, что в результате MLA могут быть выявлены веретенные яды. Предпочтительным цитогенетическим тестом in vivo в соответствии с Вариантом 2 является микроядерный анализ, а не тест на хромосомные аберрации, поскольку он имеет больше возможностей для выявления утраты хромосом (потенциал анеуплоидии).

Предполагаемый стандартный набор тестов не подразумевает, что другие тесты генотоксичности являются несостоятельными или нецелесообразными. Для дальнейшего исследования результатов анализа генотоксичности, полученных в результате применения стандартной батареи тестов могут потребоваться дополнительные анализы (см. Разделы 4.2 и 5). Также при условии достаточной валидации могут использоваться другие виды животных, включая не относящихся к грызунам.

При условиях, при которых один или несколько тестов в стандартной батарее не могут быть использованы по техническим причинам, альтернативные валидированные тесты могут обеспечить адекватную замену при условии достаточного научного обоснования.

2.3 Модификации батареи тестов

В следующих разделах представлены ситуации, в которых может потребоваться модификация стандартной батареи тестов.

2.3.1 Поисковые клинические исследования

В некоторых поисковых клинических исследованиях может использоваться меньше анализов генотоксичности либо различных критериев обоснования максимальной дозы in vivo (см. Руководство ICH M3(R2)).

2.3.2 Испытуемые препараты с бактериотоксическим действием

В случае, если вещество имеет бактериотоксические свойства (например, некоторые антибиотики), тем не менее, следует провести тест Эймса на обратную мутацию бактерий, кроме того, должно проводиться испытание цитотоксических веществ в клетках млекопитающих, поскольку мутагенность может возникать при более низких и менее токсичных концентрациях. В подобных случаях также следует провести один из анализов в клетках млекопитающих in vitro, т.е. следует проводить анализы по 1-му варианту.

2.3.3 Вещества по своей структуре имеющие генотоксический потенциал

Вещества с подозрительной структурой (Примечание 5) обычно выявляются в рамках стандартной батареи тестов, поскольку большинство «структурно подозрительных веществ определяют в контексте бактериальной мутагенности. Известно несколько химических классов веществ, которые лучше поддаются определению в рамках анализа повреждения хромосом в клетках млекопитающих, по сравнению с анализами бактериальной мутации. Таким образом, отрицательные результаты батареи тестов вещества с подозрительной структурой обычно учитывают достаточное доказательство отсутствия генотоксичности. Однако для веществ с подозрительной структурой может быть целесообразна модификация стандартных протоколов (Примечание 5). Выбор дополнительных тестов или модификации протокола зависит от химического состава, химической активности и данных о метаболизме вещества с подозрительной структурой.

2.3.4 Ограничения по применению тестов in vivo

Существует множество веществ, в отношение которых тесты in vivo (обычно в костном мозге, крови или печени) не дают полезной дополнительной информации. К ним относятся вещества, в отношении которых данные о токсикокинетике и фармакокинетике указывают на отсутствие их системной абсорбции, а следовательно, они не попадают в целевые ткани. Примерами таких веществ являются рентгеноконтрастные вещества, антациды на основе алюминия, некоторые ингаляционные препараты, а также лекарственные средства кожного или иного топикального применения. В случаях, когда модификация пути введения не обеспечивает достижения достаточной концентрации в целевых тканях, и если нет возможности провести подходящий анализ генотоксичности в наиболее подверженной воздействию ткани, может быть целесообразным в оценке опираться только на исследования in vitro. В некоторых случаях целесообразно проведение оценки генотоксических эффектов в участке контакта, при том что подобные исследования до сих пор не получили широкого распространения (Приложение 6).

2.4 Определение мутагенов зародышевых клеток

Результаты сравнительных исследований показали, что в количественном отношении большинство мутагенов зародышевых клеток могут быть обнаружены по генотоксичности в испытаниях соматических клеток, так что отрицательные результаты испытаний генотоксичности соматических клеток in vivo в целом указывают на отсутствие эффектов со стороны зародышевых клеток.

3. Рекомендации в отношении тестов in vitro

3.1 Повторение тестов и интерпретация их результатов

Воспроизводимость результатов тестов – важнейший аспект исследований, проводимых с использованием инновационных методов или неожиданных результатов, однако плановый анализ препаратов с использованием стандартных широко применяемых испытаний генотоксичности зачастую не требует повторного проведения. Данные тесты в достаточной степени характеризованы и имеют достаточный внутренний контроль, так что повторение тестов с определенно положительным или отрицательным результатом анализа, как правило, не требуется. В идеале должна быть возможность указать, что в результате проведения теста были достигнуты определенно отрицательные или определенно положительные результаты. Однако результаты испытаний иногда не удовлетворяют установленным критериям положительного или отрицательного результата и, таким образом, их считают «сомнительными». Применение статистических методов анализа может улучшить интерпретацию данных, при этом достаточная биологическая интерпретация имеет критически важное значение. При повторном проведении теста, в результате которого был достигнут сомнительный результат, может быть достигнут (i) определенно положительный результат, тогда общий результат будет положительным, (ii) отрицательный результат, в этом случае результат будет признан невоспроизводимым, а следовательно, и общий результат испытания будет отрицательным, или (iii) ее один сомнительный результат, при котором общий результат остается сомнительным.

3.2 Рекомендованный протокол анализа на бактериальные мутации

Рекомендации по протоколу представлены в руководстве OECD (1997) и отчете IWGT (Gatehouse et al., 1994).

3.2.1 Выбор высоких доз

Максимальные дозы

Максимальная рекомендованная доза составляет 5000 мкг/тарелка (для испытуемых веществ в жидкой форме), без ограничений, обусловленных свойствами растворимости или цитотоксичности.

Предел растворимости

Для бактериальных культур проводят оценку преципитирующих доз, при условии что преципитат не влияет на обработку, токсичность не является лимитирующей, а максимальная концентрация не превышает 5000 мкг/тарелка (или 5 мкл/тарелка – для испытуемых веществ в жидкой форме). В отсутствие наблюдаемой цитотоксичности самую низкую преципитирующую дозу следует использовать в качестве максимальной. Если отмечается цитотоксичность или мутагенность, независимо от растворимости, максимальная доза должна быть установлена с учетом цитотоксичности, как описано ниже.

Предел цитотоксичности

В тесте Эймса установленные дозы должны показывать признаки значительной токсичности, при этом не превышая максимальной дозы 5000 мкг/тарелка. Токсичность может быть установлена по снижению числа ревертантов и/или очистка и/или уменьшение бактериального газона.

3.2.2 Дизайн исследования / протокол тестов

Рекомендованный набор бактериальных штаммов (OECD) включает штаммы, позволяющие определить замещение основания и мутации со сдвигом рамки считывания следующим образом:

- Salmonella typhimurium TA98;

- Salmonella typhimurium TA100;

- Salmonella typhimurium TA1535;

- Salmonella typhimurium TA1537 или TA97 или TA97a;

- и Salmonella typhimurium TA102 или Escherichia coli WP2 uvrA или Escherichia coli WP2 uvrA (pKM101).

Одним из отличий от рекомендаций, изложенных в OECD и IWGT, является то, что по имеющемуся опыту испытаний лекарственных средств, однократного теста Эймса оценки обратных бактериальных мутаций достаточно при определенно отрицательном или положительном результате, а также при условии проведения испытания в полном соответствии с протоколом, включая все штаммы с метаболической активацией и без нее, соответствующий диапазон доз, удовлетворяющий критериям для выбора максимальной дозы и соответствующий положительный и отрицательный контроль. Кроме того, при испытании лекарственных средств как включение тарелки, так и метод предварительной инкубации может быть целесообразен для данного однократного эксперимента (Примечание 7). Спорные или слабоположительные результаты могут указывать на целесообразность повторного проведения испытания, возможно в рамках модифицированного протокола, например, с установлением соответствующих интервалов между уровнями доз.

3.3 Рекомендованные протоколы для проведения анализов на клетках млекопитающих

Рекомендации по протоколам изложены в руководстве OECD (1997) и в публикациях IWGT (например, Kirsch-Volders et al., 2003; Moore et al., 2006).  Также имеются рекомендации по интерпретации результатов MLA (Moore et al., 2006), включая применение глобального поправочного коэффициента. Здесь приведены некоторые различия от приведенных здесь рекомендаций при испытании лекарственных средств, в частности, при выборе максимальной концентрации (см. подробности ниже).

3.3.1 Выбор максимальной концентрации

Максимальная концентрация

Максимально рекомендованная концентрация составляет 1 мМ или 0,5 мг/мл, в зависимости от того, что ниже, при отсутствии ограничений, обусловленных растворимостью в растворителе или питательной среде или цитотоксичностью (Примечание 8).

Предел растворимости

В случае ограничивающих характеристик растворимости максимальной концентрацией, при условии ограничения со стороны цитотоксичности, должна быть наиболее низкая концентрация, при которой в культурах присутствует минимальный осадок, при условии отсутствия побочного влияния на расшифровку. Оценка преципитации может осуществляться на глаз или при помощи инструментальных методов, таких как световая микроскопия, отслеживая осадок, который сохраняется либо появляется в процессе культивирования (к концу терапии).

Цитотоксичность

При проведении цитогенетических анализов in vitro хромосомных аберраций в метафазе либо микроядерных проб, цитотоксичность может приводить к снижению роста клеток не более, чем на 50% (Примечания 9 и 10). Для MLA максимальной дозой должна быть доза, вызывающая 80-90% цитотоксичность, измеряемая по RTG в пределах 20-10% (Примечание 9).

3.3.2 Дизайн исследования /Протоколы испытаний

В целях цитогенетической оценки повреждений хромосом в клетках метафазы in vitro, протокол испытания должен включать проведение испытаний с метаболической активацией и без, с использованием соответствующего положительного и отрицательного контроля. Терапия исследуемыми препаратами должна иметь продолжительность от 3 до 6 часов, а время пробоотбора должно приблизительно в 1,5 раза превышать обычный клеточный цикл от начала терапии. Непрерывная терапия без метаболической активации продолжительностью, приблизительно в 1,5 раза превышающей нормальный клеточный цикл, должна проводиться при получении отрицательных или сомнительных результатов обоих циклов краткосрочной терапии с метаболической активацией и без нее. Аналогичные принципы распространяются на микроядерную пробу in vitro, с тем отличием, что время пробоотбора, как правило, составляет 1,5 – 2 нормальных клеточных циклов от начала терапии, чтобы обеспечить возможность полного прохождения клетками митоза и вхождения в следующую интерфазу. Для обоих цитогенетических анализов in vitro может потребоваться модификация протокола к определенным типам химических веществ, которые проще определить при более длительной терапии, отсрочивании пробоотбора или периода восстановления, например, некоторые нуклеозидные аналоги и некоторые нитрозамины. В метафазном анализе аберраций информацию о плоидическом статусе получают за счет регистрации частоту полиплоидных (включая эндоредуплицированных) метафаз в виде процента от числа клеток в метафазе. Для MLA протокол испытания должен включать проведение испытаний с метаболической активацией и без с соответствующим положительным и отрицательным контролем при продолжительности терапии исследуемым препаратом 3-4 часа. Длительная терапия без метаболической активации продолжительностью около 24 часов должна проводиться в случае получения отрицательного или сомнительного результата обоих краткосрочных циклов терапии с метаболической активацией и без нее. Стандартный MLA должен включать (i) положительный контроль, индуцирующий, главным образом, малые колонии, и (ii) изменение размера колоний для положительного контроля, контроль растворителей и минимум одну положительную концентрацию исследуемого компонента (при наличии), включая культуру, характеризующуюся наибольшей частотой выявления мутаций.

Для исследований на клетках млекопитающих in vitro должны использоваться встроенные подтверждающие элементы, подобные перечисленным выше (например, различная продолжительность терапии, тесты с метаболической активацией и без нее). После подобных анализов дальнейшие подтверждающие испытания в случае получения определенно отрицательных или положительных результатов, как правило, не требуются. При получении сомнительных или слабоположительных результатов могут потребоваться повторные тесты, возможно, в рамках модифицированного протокола, например, с установлением иных интервалов исследуемых концентраций.

3.3.3 Положительный контроль

Одновременное проведение тестов на положительных контрольных образцах важно, однако теста на клетках млекопитающих с целью выявления генетической токсичности в достаточной степени стандартизированы, так что использование положительных контрольных образцов обычно ограничивается использованием их в случае метаболической активации (при одновременном проведении с тестами без активации) с целью продемонстрировать активность системы метаболической активации и восприимчивости тест-системы.

4. Рекомендации по проведению испытаний in vivo

4.1 Тесты, проводимые с целью определения хромосомных повреждений in vivo

Для определения кластогенов подходит либо анализ хромосомных аберраций, либо измерение микроядерных полихроматических эритроцитов в костном мозге in vivo. Для проведения микроядерной пробы в костном мозге в качестве модели подходят и крысы, и мыши. Микроядра также можно исследовать в незрелых (например, полихроматических) эритроцитах в периферической крови мышей, либо в новообразованных ретикулоцитах в крови крыс (Примечание 3). Аналогичным образом, также могут использоваться незрелые эритроциты животных любого другого вида, характеризующиеся аналогичной чувствительностью к определению индукторов кластогенов / анеуплоидии в костном мозге или периферической крови (Примечание 3). При условии надлежащей валидации могут использоваться системы автоматизированного анализа (визуальный анализ и проточная цитометрия) (OECD, 1997; Hayashi et al., 2000; 2007). Анализ хромосомных аберраций также можно провести в периферических лимфоцитах, полученных от грызунов, получавших терапию (Примечание 11).

4.2 Другие испытания генотоксичности in vivo

Аналогичные испытания in vivo, описанные в качестве второго испытания в рамках стандартной батареи тестов (Вариант 2), могут использоваться в качестве контрольных испытаний для получения необходимого набора данных для оценки результатов анализов in vitro или in vivo (Примечания 11 и 12). Несмотря на то, что тип эффектов, наблюдаемых in vitro и знание механизма может помочь при выборе анализа in vivo, проведение исследований хромосомных аберраций или генных мутаций эндогенных генов в большинстве тканей нецелесообразно проводить стандартными методами. Несмотря на то, что мутации можно определять в трансгенах грызунов, это подразумевает более продолжительную терапию (например, в течение 28 дней) для экспрессии, фиксации и аккумуляции мутаций, особенно в тканях с медленно делящимися клетками (Примечание 12). Таким образом, во втором анализе in vivo в качестве суррогатной конечной точки проводят оценку повреждения ДНК. Анализы с наиболее полным опубликованным опытом и рекомендациями в рамках протоколов включают анализы поломки нитей ДНК, в том числе, анализ единичной клетки методом гель-электрофорез («Кометный анализ») и анализ разрывов ДНК, анализы трансгенных мутаций на мышах in vivo и анализы ковалентного связывания ДНК (любой из которых может применяться во многих тканях, Примечание 12) и анализ репаративного синтеза ДНК в печени (анализ UDS).

4.3 Выбор доз в рамках анализа in vivo

Обычно анализ проводят с использованием трех уровней доз (Hayashi et al., 2005).

4.3.1 Краткосрочные исследования

Для краткосрочных исследований (1-3 дозы) максимально рекомендованная доза для исследований генотоксичности представляет собой предельную дозу 2000 мг/кг при условии хорошей переносимости, либо максимально переносимую дозу, определяемую (например, для микроядерного анализа (OECD)) как дозу, вызывающую признаки токсичности такой степени выраженности, чтобы более высокие дозы при сохранении аналогичного режима