Наши услуги
О нас
Доклинические исследования
Регламент
Видео доклинические исследования
Клинические исследования
Регламент
Клинические исследования видео
Набор добровольцев
Архив исследований
Набор пациентов
Новости медицины
Интервью
Архив новостей
Контакты
Вакансии
НАВЕРХ

Регламент

OECD, Test No477:1984 Токсикология генетическая: Оценка сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций у Drosophila melanogaster

Введение

Представляемые данные по соединению:

-твердое, жидкое, парообразное или газообразное вещество;

-химическая идентификация вещества;

-чистота (примеси) вещества;

-растворимость;

-температура плавления/кипения вещества;

-рН (где необходимо);

-давление паров (если имеются данные).

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЯ ПО ВОЗДЕЙСТВИЮ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ НА ОРГАНИЗМ ЧЕЛОВЕКА


Токсикология генетическая: Метод оценки сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций у Drosophila melanogaster


OECD guidelines for the testing of chemicals. Genetic Toxicology: Sex-linked Recessive Lethal Test in Drosophila melanogaster


Дата введения -


Область применения

Метод оценки сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций на Drosophila melanogaster (СПРЛМ) применяют для выявления как точковых мутаций, так и небольших делеций в половых клетках насекомых. Это прямой тест выявления мутаций распространяется на 800 локусов Х-хромосомы, что составляет около 80% всех локусов на Х-хромосоме Z-хромосома представляет приблизительно 1/5 полного генома дрозофилы [2],

Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

летальная мутация (Lethal mutation): Изменение в геноме, проявление которого вызывает гибель носителя

рецессивная мутация (Recessive mutation): Изменение в геноме, которое проявляется в гомозиготном или гемизиготном состоянии.

положительные контроли (Reference substances):

Вещества, которые используются как положительные контроли:

-этилметансульфонат;

-N-нитрозодиметиламин.

сцепленные с полом гены (Sex-Linked): Гены находятся на половых (X и Y) хромосомах. В контексте настоящего стандарта термин «сцепленные с полом гены» распространяется на гены, локализованные на Х-хромосоме.

Принцип исследования

Мутации в Х-хромосоме Drosophila melanogasier фенотипически экспрессируются у самцов, несущих мутантный ген. Когда мутация летальна в гемизиготном состоянии, ее действие проявляется в отсутствии в потомстве одного из двух классов самцов, которые нормально появляются у гетерозиготных самок.

Метод СПРЛМ имеет преимущество в том, что проводится со специально маркированными и перестроенными хромосомами.

Описание метода

Методы проведения теста СПРЛМ на Drosophila melanogastei описаны в работах [2] и [3] Самцов дикого типа обрабатывают исследуемым веществом и скрещивают с определенными самками. Самок потомства скрещивают с их братьями. В следующей генерации потомства от каждого индивидуального скрещивания фенотипически подсчитывают самцов дикого типа. Отсутствие этих самцов указывает на то, что рецессивные сцепленные с полом летальные мутации возникли в половых клетках Р1 самцов.

Материалы

Линии

Могут применять самцов хорошо определяемого дикого типа и самок линии Muller-5. Также возможно применение других соответственно маркированных линий самок с множественными инверсиями Х-хромосомь

Тестируемое вещество

Исследуемое вещество растворяют в воде. Нерастворимые в воде вещества можно растворять или суспендировать в подходящих растворителях (например, смеси этанола и Tween-60 или Tween-80), а затем перед введением разводят в воде или физиологическом растворе. Следует избегать использования диметилсульфоксида в качестве растворителя.

Условия тестирования

Пути введения исследуемого вещества

Возможно введение оральное, инъекционное или ингаляционное с газом или парами. Кормление с исследуемым веществом может быть проведено с помощью раствора сахара. При необходимости вещество можно растворить в 0,7 %-ном растворе NaCI и инъецировать в грудную клетку или живот подопытного животного.

Уровни экспозиции

В начале оценки мутагенности применяют одну экспозицию исследуемого вещества, которая является максимально переносимой концентрации или вызывает ряд признаков токсичности. Если метод применяют для верификации, то проводят, по крайней мере, два дополнительных уровня экспозиции.

Контроли

Необходимо включать негативный контроль с растворителем. Однако, если в лаборатории накоплен большой исторический контроль, то нет необходимости ставить конкурентные контооли.

Проведение эксперимента

Самцов дикого типа (в возрасте 3-5 дней) обрабатывают исследуемым веществом и скоещивают индивидуально с избытком виргинных самок линии Muller-5 или самками других, соответственно маркированных (с множественными инверсиями ^-хромосомы) линий. Каждые 2-3 дня самок заменяют на новых виргинных самок, проводя таким образом анализ полного цикла половых клеток. Потомство этих самок позволяет учитывать летальные эффекты при воздействии на зрелую сперму, сперматиды на средней и поздней стадии, ранние сперматиды, сперматоциты и сперматогонии.

Гетерозиготных самок (F1) предыдущих скрещиваний индивидуально (одна самка на пробирку) спаривают с их братьями. В F2 генерации в каждой культуре определяют отсутствие самцов дикого типа. Если F1 самка несет летальную Х-хромосому отца (т.е. наблюдается отсутствие самцов с обработанной хромосомой), дочерей этих самок с тем же генотипом следует исследовать, чтобы оценить передается ли летальность следующим генерациям.

Для теста должна быть заранее установлена чувствительность и сила. Число особей в каждой группе должно определяться этими параметрами. Спонтанная частота мутантов, наблюдаемая в соответствующем контроле, сильно влияет на число обработанных хромосом, которое необходимо проанализировать, чтобы выявить вещества, индуцирующие частоту мутаций, близкую к таковой в контроле.

Результаты теста должны быть подтверждены в отдельном эксперименте.

Результаты и отчет

Обработка результатов

Данные следует представлять в табличной форме, указывая число тестируемых хромосом, число нефертильных самок, число летальных хромосом для каждой концентрации вещества, каждого периода скрещивания на каждого обработанного самца. Следует представить число кластеров разных размеров на самца.

Для оценки сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций применяют различные статистические методы. Кластеры рецессивных леталей от одного самца следует учитывать и оценивать соответствующими статистическими приемами.

Оценка результатов

Существуют разные критерии определения позитивного результата, один из которых - статистически значимое повышение частоты сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций с возрастанием дозы. Другой критерий - воспроизводимый статистически значимый положительный эффект хотя бы на одной экспериментальной точке.

Вещество, не вызывающее ни статистически значимого повышения частоты сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций с возрастанием дозы, ни статистически значимого положительного эффекта хотя бы на одной экспериментальной точке, считается не мутагеном в настоящей тест-системе.

Как биологическая, так и статистическая значимость должны оцениваться совместно пои анализе результатов.

Отчет

Отчет должен содержать следующую информацию: -сток: сток и линии применяемых дрозофил; возраст насекомых; число обработанных самцов; число стерильных самцов; число поставленных Р2-культур; число Р2-культур без потомства; число исследованных хромосом, число хромосом, несущих летальные мутации для половых клеток каждой стадии

- условия тестирования: детальное описание схемы обработки и проведения опыта; уровни экспозиции, данные по токсичности, негативные (растворитель) и позитивные контроли;

- критерии учета летальных мутаций;

- анализ зависимости «экспозиция-эффект» (там. где проводилась);

- статистическую оценку.

Интерпретация результатов

Положительный результат в тесте на сцепленную с полом рецессивную леталь (СПРЛМ) на дрозофиле показывает, что вещество индуцирует мутации в половых клетках насекомого

 

Отрицательный результат предполагает, что при указанных условиях тестирования вещество не индуцирует мутации в половых клетках насекомого.

Библиография

1) Руководящий документ OECD Test № 477 «Genetic Toxicology: Sex-linked Recess./е Lethal Test in Drosophila melanogaster»

2) H. Sobels and E Vogel, Mutation Res. 41, 95-106 (1976)

3) E. Wurgler, H. Sobeis and E Vogel, i Handbook of Mutagenicity Test Procedures (edited by B.J. Kilbey, et al.), pp. 335-373, Elsevier, Amsterdam (1977)