Наши услуги
О нас
Доклинические исследования
Регламент
Видео доклинические исследования
Клинические исследования
Регламент
Клинические исследования видео
Набор добровольцев
Архив исследований
Набор пациентов
Новости медицины
Интервью
Архив новостей
Контакты
Вакансии
НАВЕРХ

Регламент

S8 Исследования иммунотоксичности лекарственных средств, предназначенных для человека

МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ ПО ГАРМОНИЗАЦИИ ТЕХНИЧЕСКИХ ТРЕБОВАНИЙ К РЕГИСТРАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА

 

Гармонизированное трехстороннее руководство ICH

Исследования иммунотоксичности лекарственных средств, предназначенных для человека

S8

Действующая версия 4 этапа
от 15 сентября 2005 г.

 

Данное Руководство было разработано соответствующей Экспертной рабочей группой ICH, оно было представлено на рассмотрение регуляторным органам в рамках процесса ICH. На 4 этапе процесса финальный проект рекомендован для принятия регуляторными органами Европейского Союза, Японии и США.

 

S8
История документа

















Первая кодификация История Дата Новая кодификацияноябрь 2005 г.
S8 Одобрение Руководящим комитетом в рамках 2 этапа и вынесение на общественное обсуждение. 18 ноября 2004 г. S8

Текущая версия в рамках 4 этапа











S8 Одобрение Руководящим комитетом в рамках 4 этапа и рекомендация к принятию тремя регуляторными органами ICH. 15 сентября 2005 г. S8

 

Исследования иммунотоксичности лекарственных средств, предназначенных для человека

Гармонизированное трехстороннее руководство ICH

По достижении 4 этапа процесса ICH в рамках встречи Руководящего комитета ICH 15 сентября 2005 г., данное руководство рекомендовано к принятию тремя регуляторными органами ICH

 

 

 

Исследования иммунотоксичности лекарственных средств, предназначенных для человека

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1 Цели руководства

Цели данного руководства состоят в том, чтобы (1) представить рекомендации по доклиническим исследованиям с целью выявления компонентов, которые потенциально могут обладать иммунотоксичностью и (2) обеспечить руководство по подходу к принятию решений на основе имеющихся доказательств  в области исследований иммунотоксичности. В рамках настоящего руководство под иммунотоксичностью понимается непредусмотренная иммуносупрессия или усиление иммунных реакций. Лекарственно обусловленные гиперчувствительность и аутоиммунные реакции не входят в область рассмотрения данного руководства.

1.2 Справочная информация

Оценка потенциального нежелательного действия лекарственных препаратов на иммунную систему человека должна включаться в стандартный процесс разработки лекарственных средств. Токсическое воздействие на иммунную систему включает целый ряд нежелательных эффектов. К ним относится подавление или усиление иммунного ответа. Подавление иммунного ответа может привести к снижению сопротивляемости организма к возбудителям инфекции или опухолевым клеткам. Усиление иммунного ответа может привести к обострению проявлений аутоиммунных заболеваний либо к гиперчувствительностью. Лекарственное средство либо аддукты белка препарата также могут быть распознаны как чужеродные и стимулировать ответ, направленный против препарата. Последующее применение препарата может привести к реакциям гиперчувствительности (аллергическим реакциям). Во много научные разработки и усилия по разработке и валидации метода были направлены на оценку препаратов-кандидатов, находящихся в разработке, на предмет потенциального риска вызывать иммуносупрессию либо контактную аллергию. В настоящее время отсутствуют стандартные подходы к исследованию лекарственных препаратов, предназначенных для человека на предмет респираторной либо системной алллергенности (антигенности) либо лекарственных аутоиммунных реакций. Испытания с такими конечными точками в настоящее время не являются обязательными ни в одном из регионов. Региональных различий с точки зрения подходов к исследованиям кожной сенсибилизации не существует.

Иммуносупрессия либо усиление иммунных реакций может быть вызвано двумя группами препаратов:

- Лекарственные средства, предназначенные для модуляции иммунной функции в терапевтических целях (например, для профилактики отторжения органов), в случае, если нежелательная иммуносупрессия может рассматриваться в качестве избыточной фармакодинамики;

- Лекарственные средства, не предназначенные для воздействия на иммунитет, но вызывающие иммунотоксичность, например, в связи с некрозом или апоптозом иммунных клеток либо взаимодействием с клеточными рецепторами, общими для целевых тканей или нецелевых клеток иммунной системы.

В качестве примера препаратов, вызывающих нежелательную иммуносупрессию, можно назвать антипролиферативные препараты, используемые для лечения рака. В этих случаях нежелательные результаты доклинических исследований достаточно прямо указывают на иммунотоксичность у человека. Поэтому проведение специальных анализов для определения иммунотоксичности, скорее всего, не целесообразно при оценке риска, поскольку целевые ткани обычно представляют собой быстро делящиеся клетки, например, клетки-предшественники иммунной системы из костного мозга. Поэтому нежелательное действие на иммунную систему может быть спрогнозировано на основании фармакологической активности и может быть достоверно изучено в рамках доклинических исследований. Что касается других типов веществ, не предназначенных для подавления иммунного ответа, различение между избыточной фармакодинамикой и нецелевыми эффектами менее очевидно. Например, некоторые противовоспалительные препараты могут повлиять на некоторые врожденные иммунные функции, но не обязательно – на адаптивный иммунный ответ.

1.3 Область применения руководства

Данное руководство направлено на предоставление рекомендаций по доклиническим исследованиям иммунотоксичности лекарственных средств, предназначенных для человека. Область применения данного руководства ограничивается нежелательной иммуносупрессией или избыточным иммунным ответом, не включая случаев аллергенности или лекарственно-обусловленных аутоиммунных реакций.

Данное руководство применимо ко всем новым лекарственным средствам, предназначенным для человека, а также к зарегистрированным препаратам при расширении списка показаний либо внесения иных изменений в существующую инструкцию, если подобное изменение может привести к новым значимым иммунотоксическим реакциям.  Кроме того, данное руководство также распространяется на препараты, в отношении которых клинические признаки иммунотоксичности отмечались при проведении клинических исследований и после регистрации и выведения на рынок. Данное руководство не распространяется на лекарственные средства, полученные биотехнологическим путем, рассмотренные в Руководстве ICH S61 , и на другие биологические препараты.

Существующие методические документы о сенсибилизации и гиперчувствительности остаются в силе, данный документ на них не влияет. Данный документ не ставит себе целью предоставить специфические рекомендации относительно того, как следует проводить каждое исследование иммунотоксичности. Общие методические рекомендации даны в приложении.

1.4 Общий обзор

К данному руководству применимы следующие общие принципы:

- Все новые лекарственные средства, предназначенные для человека, следует оценивать с точки зрения потенциальной способности вызывать иммунотоксические реакции;

- Методики включают стандартные исследования токсичности (СИТ) или дополнительные исследования токсичности, проводимые в установленном порядке. Вопрос о целесообразности проведения дополнительных исследований иммунотоксичности решается на основании совокупного анализа факторов, изложенных в разделе 2.1.

Описание нижеизложенного руководства проводится в соответствии с рекомендованным процессом принятия решений в рамках оценки иммунотоксиности, как показано на блок-схеме (Рисунок 1). Более подробное описание методов проведения испытаний представлено в Приложении.

2. РУКОВОДСТВО

2.1 Факторы, учитываемые при оценке потенциальной иммунотоксичности

Выделяют следующие факторы, которые обусловливают необходимость дальнейших исследований иммунотоксичности (1) Результаты СИТ; (2) фармакологические свойства препарата, (3) целевая категория пациентов, (4) структурное сходство с известными иммуномодуляторами, (5) распределение лекарственного средства и (6) клиническая информация.

Начальный скрининг на потенциальную иммунотоксичность включает стандартные исследования токсичности. При этом следует учитывать данные исследований на грызунах и животных, относящихся к другим отрядам, как краткосрочных, так и долгосрочных. Дополнительная информация по изучаемым параметрам и правила сообщения о результатах гистопатологического анализа представлены в Приложении.

2.1.1 Стандартные исследования токсичности

Данные СИТ следует анализировать с точки зрения наличия признаков иммунотоксичности. Следует учитывать следующие признаки:

1) Изменения гематологических параметров, такие как лейкоитопения / лейкоцитоз, гранулоцитопения / гранулоцитоз либо лимфопения / лимфоцитоз;

2) Изменение массы органов иммунной системы и/или гистологические изменения (например, изменения тимуса, селезенки, лимфатических узлов и/или костного мозга);

3) Изменение сывороточного глобулина, возникающие без правдоподобного объяснения, например, воздействие на печень или почки, могут свидетельствовать об изменении уровня иммуноглобулинов в сыворотке;

4) Повышение частоты инфекций;

5) Повышение частоты опухолей как признак иммуносупрессии в отсутствие других вероятных причин, таких как генотоксичность, гормональные эффекты либо индукция ферментов печени.

Изменения по этим параметрам могут отражать наличие иммуносупрессии либо повышенную активацию иммунной системы. Иммуносупрессия, как правило, выражается в виде снижения значений по параметрам иммунной функции, а усиление иммунного ответа  - в виде роста по данным параметрам. Однако данная взаимосвязь не абсолютная и в некоторых случаях может быть нарушена.

Аналогично оценке риска токсичности в других системах органов, оценка иммунотоксичности должна проводиться с учетом следующих факторов

- Статистическая и биологическая значимость изменений;

- Степень тяжести эффектов;

- Взаимосвязь доза/воздействие;

- Фактор безопасности сверх ожидаемой клинической дозы;

- Продолжительность терапии;

- Количество использованных биологических видов животных и конечные точки;

- Изменения, которые могут произойти под воздействием других факторов (например, стресса, см. Приложение, раздел 1.4);

- Возможные клеточные мишени и/или механизм действия;

- Дозы, при которых проявляются эти изменения, относительно доз, при которых проявляются другие виды токсичности и

- Обратимость эффектов.

2.1.2 Фармакологические свойства

Если фармакологические свойства исследуемого вещества свидетельствуют о его потенциальной способности воздействовать на иммунную функцию (например, в случае противовоспалительных препаратов), следует рассмотреть возможность проведения дополнительных анализов иммунотоксичности. Информация, полученная в рамках доклинических фармакологических исследований о способности препарата воздействовать на иммунную систему может быть использована в рамках подхода с учетом совокупности доказательств при принятии решения о необходимости проведения дополнительных исследований иммунотоксичности.

2.1.3 Предполагаемые категории больных

Проведение дополнительных исследований иммунотоксичности целесообразно в случае если большинство пациентов, которым показан препарат, имеют иммунодефициты, обусловленные спецификой заболевания или проводимой терапией.

2.1.4 Структурное подобие

Вещества, сходные по своей структуре с веществами, обладающими подтвержденными иммуносупрессивными свойствами, также должны рассматриваться в качестве возможных кандидатов для проведения анализа иммунотоксичности.

2.1.5 Распределение препарата

Если препарат и/или его метаболиты сохраняются в высоких концентрациях в клетках иммунной системы, следует рассмотреть вопрос о проведении дополнительного исследования иммунотоксичности.

2.1.6 Признаки, наблюдаемые в клинических исследованиях или в ходе клинического применения препарата

Результаты клинических исследований, свидетельствующие об иммунотоксичности у пациентов, получающих препарат, могут свидетельствовать о необходимости проведения дополнительных доклинических исследований иммунотоксичности.

2.2 Анализ совокупности имеющихся данных

Необходимо провести анализ совокупности имеющихся данных, учитывающих все факторы, описанные выше, для установления вероятного основания для беспокойства. Результаты достаточного масштаба в одной области могут повлечь за собой необходимость проведения дополнительных исследований иммунотоксичности. Результаты анализа двух и более факторов, каждый из которых по отдельности был бы недостаточен, также могут обусловить необходимость проведения дополнительных исследований. Если дополнительные исследования иммунотоксичности не проводятся, спонсор должен предоставить соответствующее обоснование этого факта.

3. ВЫБОР И ДИЗАЙН ДОПОЛНИТЕЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ИММУНОТОКСИЧНОСТИ

3.1 Цели

При выявлении основания для беспокойства должны быть проведены дополнительные исследования иммунотоксичности для уточнения иммунотоксического потенциала препарата. Такие исследования могут помочь выявить обратимость эффектов в подвергнутых изменениям типах клеток, а также механизм действия. Подобная информация также может указывать на потенциальный риск и, возможно, привести к выбору биомаркеров для клинических исследований.

3.2 Выбор анализов

Если анализ имеющихся сведений указывает на необходимость проведения дополнительных исследований иммунотоксичности, могут быть использованы различные анализы. В случае изменений результатов стандартных исследований токсичности, свидетельствующих о наличии иммунотоксичности, тип дополнительных исследований иммунотоксичности, который можно счесть подходящим, будет зависеть от сути наблюдаемых иммунологических изменений и от проблем, характерных для препаратов данного класса. Рекомендовано проводить исследование иммунной функции, например, Т-зависимого ответа антител (TЗОА). Если конкретные типы клеток, выявленные в СИТ, не участвуют в анализе ТЗОА, можно рассмотреть возможность проведения анализов по измерению функции клеток данного типа (см. Приложение). Если конкретная мишень не определена, рекомендовано исследование иммунной функции, например, ТЗОА.

Кроме того, иммунофенотипирование популяций лейкоцитов, нефункциональный анализ, может проводиться с целью идентификации определенных затронутых проблемой популяций клеток, что может обеспечить получение полезных клинических биомаркеров.

3.3 Дизайн исследования

Для оценки лекарственно обусловленной иммунотоксичности общепринятый дизайн исследования  на грызунах предполагает исследование продолжительностью 28 дней с последовательным ежедневным дозированием. Описаны случаи адаптации дизайна анализа иммунотоксичности, предполагающие использование животных, не относящихся к отряду грызунов. Вид животных, штаммы, дозы, продолжительность терапии и путь введения в дополнительных исследованиях иммунотоксичности должны по возможности соответствовать таковым для стандартного исследования токсичности, в котором отмечались нежелательные эффекты со стороны иммунной системы. Обычно  в таких исследованиях принимают участие животные обоих полов, за исключением случаев проведения исследований на приматах. Если при проведении исследований на животных других видов, берутся животные только одного пола, должно быть представлено обоснование. Высокая доза должна превышать уровень, не вызывающий неблагоприятных изменений (NOAEL), но должна быть ниже уровня, приводящего к изменениям, вызванным стрессом (см. Приложение, раздел 1.4). Для определения взаимосвязи доза-ответ и дозы, при которой наблюдается иммунотоксичность, рекомендовано в исследовании использовать несколько уровней доз.

3.4 Оценка дополнительных исследований иммунотоксичности и необходимость проведения дальнейших исследований

Результаты дополнительных исследований иммунотоксичности следует оценивать с точки зрения наличия достаточного объема данных, позволяющих в достаточной степени установить риск иммунотоксичности:

1. Дополнительные исследования могут указать на отсутствие возможности выявления риска иммунотоксичности и отсутствие необходимости проведения дальнейших испытаний;

2. Дополнительные исследования могут указывать на риск иммунотоксичности, но не обеспечивать получение достаточных данных для принятия рационального решения относительно соотношения риск/польза. В этом случае дополнительные анализы могут обеспечить получение достаточной информации для принятия решения о соотношении польза/риск;

3. Если общий анализ риск/польза указывает на приемлемость риска иммунотоксичности и/или может быть учтен в плане управления рисками (см. руководство ICH E2E2), дальнейшего испытания на животных может не потребоваться.

4. СРОКИ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ ИММУНОТОКСИЧНОСТИ ОТНОСИТЕЛЬНО КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Если анализ совокупности имеющихся данных указывает на необходимость проведения дополнительных исследований иммунотоксичности, они должны быть проведены до начала применения препарата в больших популяциях пациентов, обычно, в рамках исследований III фазы. Это позволит соответствующим образом включить Процедура контроля за ходом доклинического (неклинического) исследования и обеспечением его проведения, сбора данных и представления результатов исследования согласно протоколу, стандартным операционным процедурам и настоящему стандарту.мониторинг параметров функции иммунной системы в  программу клинических исследований. Время проведения дополнительных анализов иммунотоксичности определяется в зависимости от особенностей эффектов исследуемого вещества и типа клинических испытаний, которые необходимы в случае положительного результата анализа дополнительных исследований иммунотоксичности. Если целевые категории пациентов имеют иммунодефицитные состояния, анализ иммунотоксичности может быть начат на более раннем этапе разработки препарата.

5. ССЫЛКИ

1. ICH Harmonised Tripartite Guideline (S6) “Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals”

2. ICH Harmonised Tripartite Guideline (E2E) “Pharmacovigilance Planning”

Рисунок 1: Блок-схема рекомендованной оценки иммунотоксичности



























































Все лекарственные средства, предназначенные для человека (не биологические препараты)    
(2.1.) Идентификация факторов, подлежащих рассмотрению    
(2.2) Анализ совокупности имеющихся данных (СД)    
Анализ СД указывает на необходимость проведения дополнительных исследований иммунотоксичности? НЕТ Дополнительные Биомедицинские исследования, проводимые без участия человека в качестве субъекта.доклинические исследования иммунотоксичности не нужны
ДА    
(3.0) Провести дополнительные исследования иммунотоксичности    
(3.4) Отмечаются значительные изменения? НЕТ (3.4 Рt 1) Дополнительные доклинические исследования иммунотоксичности не нужны
ДА    
(3.4.) Достаточно ли данных для оценки риска / управления риском? ДА (3.4 Рt 1) Дополнительные доклинические исследования иммунотоксичности не нужны
НЕТ    
(3.4 Pt2) Рассмотреть необходимость проведения дальнейших исследований иммунотоксичности  

ПРИЛОЖЕНИЕ: Методы оценки иммунотоксичности

1. Стандартные исследования токсичности

В следующей таблице перечислены параметры, которые следует оценивать в рамках стандартных исследований токсичности на предмет признаков иммунотоксичности. Эти параметры (за исключением гематологических и клинических биохимических параметров) и методы получения образцов и оценки срезов тканей описаны более подробно в документах, разработанных профессиональными обществами токсикологической патологии.



























Параметр Специфический компонент
Гематология Общее и абсолютное дифференциальное количество лейкоцитов
Клиническая химия Уровень глобулина1 и соотношение A/G
Макропатология Лимфоидные органы и ткани
Масса органов Тимус, селезенка (необязательно: лимфатические узлы)
Гистология Тимус, селезенка, дренирующий лимфатический узел и минимум один дополнительный лимфатический узел, костный мозг2, пейеровы бляшки3, BALT4, NALT4

1Необъяснимое изменение уровня глобулина может потребовать измерения уровня иммуноглобулинов.

2Необъяснимое изменение гистопатологических характеристик линий клеток периферической крови может свидетельствовать о целесообразности цитологической оценки костного мозга.

3Только для приема внутрь.

4Только для ингаляционного или назального введения. BALT: лимфоидная ткань, ассоциированная с бронхами. NALT: назально-ассоциированная лимфоидная ткань

1.1 Гематология и клиническая химия

Подсчет общего числа лейкоцитов и абсолютный дифференцированный подсчет лейкоцитов необходимы для оценки иммунотоксичности. При оценки изменения уровня глобулина следует учитывать другие факторы (например, токсическое воздействие на печень, нефротоксичность). Изменение уровня глобулина в сыворотке может свидетельствовать на наличие изменения уровня иммуноглобулинов в сыворотке. Несмотря на то, что уровень иммуноглобулинов в сыворотке не является чувствительным индикатором иммуносупрессии, изменение уровня иммуноглобулина может быть полезным в некоторых ситуациях, обеспечивая более точное понимание популяций клеток-мишеней и механизма действия препарата.

1.2 Макропатология и масса органов

Все лимфоидные ткани следует изучать на предмет макроскопических изменений при вскрытии. Это исследование трудно провести для пейеровых бляшек у грызунов в связи с малым размером последних. Также следует регистрировать массу тимуса и селезенки. Для сведения к минимуму вариабельности массы селезенки у собак и обезьян рекомендовано полное обескровливание животных при некропсии. Возрастная атрофия тимуса может помешать точному определению массы тимуса.

1.3 Гистопатологическое обследование

Гистопатологические изменения селезенки и тимуса следует оценивать в качестве индикатора системной иммунотоксичности. Должна быть исследована лимфоидная ткань, осуществляющая дренаж либо контактирующая с участком введения препарата (а следовательно, подверженная наибольшим концентрациям препарата). К таким участкам относятся пейеровы бляшки и мезентерические лимфатические узлы в случае препаратов, принимаемых внутрь, и лимфоидная ткань, ассоциированная с бронхами (BALT) – для препаратов, вводимых в виде ингаляции, и назально-ассоциированная лимфоидная ткань (NALT) для препаратов, вводимых путем ингаляции или интраназально (если это возможно), и наиболее проксимальные регионарные дренажные лимфатические узлы для препаратов, применяемых накожно, внутримышечно, внутрикожно, интратекально или подкожно. Выбор конкретного лимфатического узла и дополнительного лимфатического узла происходит по усмотрению спонсора, на основании имеющегося у спонсора опыта. Для препаратов, вводимых внутривенно, в качестве дренажной лимфоидной ткани рассматривают селезенку.

При регистрации изменений и сообщении о лекарственно-обсуловленном изменении лимфоидных тканей рекомендовано проводить полуколичественное описание изменений в компартментах лимфоидных тканей.

1.4 Интерпретация изменений, вызванных стрессом

При проведении стандартных исследований токсичности дозы, близкие к максимально переносимой дозы, могут привести к стресс-обусловленному изменению иммунной системы (например, к избыточному фармакодинамическому действию). Воздействие на иммунную систему могут быть опосредованы усиленным высвобождением кортикостерона либо кортизола или других медиаторов. К частым стресс-опосредованным иммунным изменениям относят рост уровня нейтрофилов и снижение уровня лимфоцитов в циркулирующей крови, снижение массы тимуса, снижение клеточности коркового вещества тимуса и связанные с ним гистопатологические изменения, изменения клеточного содержимого селезенки и лимфатических узлов. Также отмечен рост массы надпочечников и/или гистологические признаки гиперплазии коры надпочечников. Снижение массы тимуса при наличии клинических признаков, таких как снижение массы тела и физической активности также относили на счет стресса. Эти результаты сами по себе не являются достаточным свидетельством стресс-опосредованной иммуногтоксичности. Признаки стресса должны быть достаточно убедительными, чтобы представлять собой достаточное основание для отказа от проведения дополнительных исследований иммунотоксичности.

2. Дополнительные исследования иммунотоксичности

2.1 Характеристика и Документированное подтверждение того, что процесс, проводимый в пределах установленных параметров, может осуществляться эффективно и с воспроизводимыми результатами.валидация анализа

Обычно выбирают широко применяемые методики проведения теста иммунотоксичности, показавшие достаточную чувствительность и специфичность по отношению к иммуносупрессивным веществам. Однако в некоторых ситуациях методики могли не пройти достаточной валидации, а анализ мог не быть широко используемым. В таких ситуациях необходимо научное/механистическое основание для использования данного метода анализа; по необходимости следует использовать положительный контроль.

Могут существовать колебания ответа для каждого типа испытания иммунотоксичности, используемого различными лабораториями. В большинстве случаев изменения не влияют на способность к оценке иммунотоксичности. Однако для обеспечения необходимого качества выполнения анализа и профессионализма лаборатории, следует соблюдать несколько стандартных технических параметров валидации. Эти параметры включают определение прецизионности внутри одного опыта и в серии опытов, прецизионность при проведении анализа разными лаборантами, предел количественного определения, линейный участок количественного определения и стабильность исследуемого образца. Кроме того, следует установить чувствительность анализа к известным веществам с иммуносупрессивным действием. Рекомендовано проводить каждый лабораторный тест с положительным контрольным препаратом параллельно экспериментальном либо проводить такие испытания периодически для подтверждения эффективности методики, кроме исследований, проводимых на приматах. При иммунофенотипировании, при условии надлежащей технической валидации, во включении положительных контрольных образцов в каждое исследование может не возникнуть необходимости.

Исследования иммунотоксичности должны проводиться в соответствии с требованиями надлежащей лабораторной практики (Good Laboratory Practice - GLP). Предполагается, что некоторые специализированные анализы, например, из числа описанных ниже, могут не  соответствовать требованиям GLP полностью.

2.2 T-клеточно зависимый гуморальный иммунный ответ (TDAR)

Анализ TDAR  следует проводить при помощи установленного Т-клеточно зависимого антигена (например, эритроциты овцы (SRBC) или гемоцианин лимфы улитки (KLH)), приводящего к достижению стойкого ответа антител. Выбранная конечная точка должна быть обоснована в качестве наиболее подходящей для выбранного анализа и биологического вида.

Антигены для иммунизации не следует использовать с адъювантами без надлежащего основания. Алюминий можно использовать только в исследованиях на приматах. Относительный ответ TDAR может зависеть от линии животных, особенно в случае исследований на мышах. В случае аутбредных крыс может иметь место значительная вариабельность между крысами внутри одной группы. Инбредные линии крыс могут использоваться при условии достаточных данных для сопоставления с линиями животных в СИТ.

Антитела можно определять при помощи ELISA или других методик иммунного анализа.  Одним из преимуществ данного метода над  ответом со стороны антителообразующих клеток является то, что образцы можно собирать периодически в течение всего периода проведения исследования.  У обезьян серийный сбор клеток крови играет большую роль благодаря высокой вариабельности кинетических параметров ответа у разных животных. В этих исследованиях данные могут быть выражены в виде суммы ответа антител для нескольких дней сбора (например, площадь под кривой).

В случае, если для анализа ELISA используют антигены SRBC, приготовление покрытого иммобилизованного антигена, в тарелках – критически важный момент. В качестве иммобилизованного антигена SRBC могут использоваться цельные фиксированные эритроциты или мембранные препараты. Результаты анализа ELISA следует выражать либо в виде концентрации, либо в виде титра, а выражение их в единицах оптической плотности не рекомендовано.

2.3 Иммунофенотипирование

Иммунофенотипирование – это идентификация и/либо подсчет групп лейкоцитов при помощи антител. Иммунофенотипирование, как правило, проводят методом флоуцитометрического анализа или иммуногистохимических методов.

Проточная цитометрия, используемая для подсчета определенных популяций клеток, не является функциональным методом анализа. Однако поточная цитометрия может применяться для определения антиген-специфического иммунного ответа со стороны лимфоцитов. Данные периферической крови могут представлять собой полезный мост для клинических исследований, в которых также проводится оценка лейкоцитов периферической крови. Рекомендовано при оценке изменений, обусловленных терапией, учитывать абсолютное количество подгрупп лимфоцитов, а также процентные соотношения.

Одним из преимуществ иммуногистохимического анализа над проточной цитометрией является то, что ткани стандартных исследований токсичности могут быть подвержены ретроспективному анализу при наличии признаков иммунотоксичности. Некоторые маркеры лимфоцитов для определенных видов чувствительны к фиксации формалином и могут быть локализованы только в тканях, фиксированных определенными фиксаторами, либо в быстрозамороженных тканях. Количественное определение лейкоцитов и интенсивность окрашивания оценить при использовании иммуногистохимического метода гораздо труднее.

Если исследования имм