Регламент

Метод основан на образовании вокруг клеток, продуцирующих антитела с высокой гемолитической активностью (IgM-антитела), сферической зоны лизиса после добавления антигена и комплемента. Существует значительное количество модификаций метода Ерне и Нордина, поэтому исполнители могут выбрать вариант, оптимально отвечающий задаче конкретного исследования.

Мышам вводят внутрибрюшинно или внутривенно суспензию трижды отмытых в стерильном физиологическом растворе эритроцитов барана (ЭБ) в субоптимальной дозе, равной 5 х 10⁷ ЭБ/мышь. Рекомендуется, чтобы пути введения антигена и тестируемого препарата различались. Поэтому препарат согласно предполагаемому способу клинического использования вводят иным путём в 2 дозах по схемам , указанным выше . На 5 сутки после иммунизации при внутрибрюшинном введении (на 4-е сутки после внутривенной иммунизации) определяют число АОК в селезёнке. Целесообразно также проведение реакции локального гемолиза на предмет обнаружения возможного влияния на спонтанное бляшкообразование (в эксперимент добавляют 3 группы без введения ЭБ: две с введением препарата и одна - интактные животные). Наличие эффекта поликлональной активации будет свидетельствовать о риске развития аутоиммунного состояния.

Постановка реакции. Животных подвергают эвтаназии с помощью цервикальной дислокации, извлекают селезенки и готовят клеточную суспензию при помощи стеклянного гомогенизатора. Суспендирование проводят в растворе Хенкса (рН 7,2-7,4) в объёме 5 мл на холоде. Приготовленную суспензию фильтруют через 1 слой капрона и помещают в холодильник.

Приготовление агарозной смеси. Расплавленную в дистиллированной воде 2 % агарозу (пригодна агароза различных фирм) добавляют к равному объему нагретого до 45-48°С однократного и двукратного (10-кратный концентрат, разведённый в 5 раз дистиллированной водой) раствора Хенкса. Соотношение компонентов смеси – 1:1:1. В приготовленную таким образом агарозу вносят суспензию ЭБ (концентрация 6-8 млрд/мл) из расчёта 70-80 млн. клеток на 1 мл агарозной смеси. По 2,75 мл полученной смеси разливают по пробиркам, предварительно помещённым в водяную баню с температурой 46-48°С. Далее в пробирки, содержащие агарозу с ЭБ, вносят определённое количество суспензии селезёночных клеток (как правило, 0,05-0,2 мл), желательно определить его в предварительных опытах. Содержимое пробирок встряхивают и выливают на чашки Петри (диаметр чашки 100 мм). Осторожным покачиванием и вращением смесь равномерно распределяют по дну чашки. После застывания агарозы чашки помещают в термостат при 37,5°С на 1 час. Затем на поверхность агарозы в чашках наливают по 3 мл раствора сухого комплемента морской свинки (разведение в физиологическом растворе 1:5) и вновь инкубируют в термостате при 37°С в течение 45 мин. После инкубации комплемент сливают и проводят подсчёт образовавшихся бляшек (зон гемолиза). При относительно небольшом числе бляшек (примерно до 120 на чашку) их подсчитывают полностью. Если же бляшек больше, то их подсчёт производят следующим образом. В листе плотной чёрной бумаги вырезают отверстие в форме квадрата со стороной 1 см (т.е. площадью 1 см² ). Подкладывая лист с вырезанным квадратом под донышко чашки, просчитывают выборочной число бляшек в 10 таких квадратах в разных участках чашки с последующим перерасчётом на всю поверхность агарозы в чашке (коэффициент перерасчёта для чашек диаметром 100 мм равен 6,88). Зная объём клеточной суспензии, наносимый на чашку, и общий объём селезёночной суспензии вычисляют количество бляшек (АОК) на всю селезёнку.

При статистической обработке полученных данных определяют среднюю геометрическую числа АОК, и стандартную ошибку. При сравнении результатов применяют критерий t Стьюдента. Достоверными считают различия при Р < 0,05 . При постановке экспериментов необходимо использовать не менее 6-10 животных в группе. Итоговые результаты являются суммарными показателями по крайней мере 2 опытов.

Реакцию Ерне можно заменить определением на 7 сутки после иммунизации титра антител в сыворотке крови мышей с помощью реакции гемагглютинации.

Список литературы:

Хаитов Р.М., Атауллаханов Р.И., Иванова А.С. и др. Методические указания по оценке иммунотоксического действия фармакологических веществ. — М., 2000.