Наши услуги
О нас
Доклинические исследования
Регламент
Видео доклинические исследования
Клинические исследования
Регламент
Клинические исследования видео
Набор добровольцев
Архив исследований
Набор пациентов
Новости медицины
Интервью
Архив новостей
Контакты
Вакансии
НАВЕРХ

Регламент

Определение числа антителообразующих клеток (АОК)

Определение числа антителообразующих клеток (АОК)


Метод основан на образовании вокруг клеток, продуцирующих антитела с высокой гемолитической активностью (IgM-антитела), сферической зоны лизиса после добавления антигена и комплемента. Существует значительное количество модификаций метода Ерне и Нордина, поэтому исполнители могут выбрать вариант, оптимально отвечающий задаче конкретного исследования.

Мышам вводят внутрибрюшинно или внутривенно суспензию трижды отмытых в стерильном физиологическом растворе эритроцитов барана (ЭБ) в субоптимальной дозе, равной 5 х 107  ЭБ/мышь. Рекомендуется, чтобы пути введения антигена и тестируемого препарата различались. Поэтому препарат согласно предполагаемому способу клинического использования вводят иным путём в 2 дозах по схемам , указанным выше . На 5 сутки после иммунизации при внутрибрюшинном введении (на 4-е сутки после внутривенной иммунизации) определяют число АОК в селезёнке. Целесообразно также проведение реакции локального гемолиза на предмет обнаружения возможного влияния на спонтанное бляшкообразование (в эксперимент добавляют 3 группы без введения ЭБ: две с введением препарата и одна - интактные животные). Наличие эффекта поликлональной активации будет свидетельствовать о риске развития аутоиммунного состояния.

Постановка реакции. Животных подвергают эвтаназии с помощью цервикальной дислокации, извлекают селезенки и готовят клеточную суспензию при помощи стеклянного гомогенизатора. Суспендирование проводят в растворе Хенкса (рН 7,2-7,4) в объёме 5 мл на холоде. Приготовленную суспензию фильтруют через 1 слой капрона и помещают в холодильник.

Приготовление агарозной смеси. Расплавленную в дистиллированной воде 2 % агарозу (пригодна агароза различных фирм) добавляют к равному объему нагретого до 45-48°С однократного и двукратного (10-кратный концентрат, разведённый в 5 раз дистиллированной водой) раствора Хенкса. Соотношение компонентов смеси – 1:1:1. В приготовленную таким образом агарозу вносят суспензию ЭБ (концентрация 6-8 млрд/мл) из расчёта 70-80 млн. клеток на 1 мл агарозной смеси. По 2,75 мл полученной смеси разливают по пробиркам, предварительно помещённым в водяную баню с температурой 46-48°С. Далее в пробирки, содержащие агарозу с ЭБ, вносят определённое количество суспензии селезёночных клеток (как правило, 0,05-0,2 мл), желательно определить его в предварительных опытах. Содержимое пробирок встряхивают и выливают на чашки Петри (диаметр чашки 100 мм). Осторожным покачиванием и вращением смесь равномерно распределяют по дну чашки. После застывания агарозы чашки помещают в термостат при 37,5°С на 1 час. Затем на поверхность агарозы в чашках наливают по 3 мл раствора сухого комплемента морской свинки (разведение в физиологическом растворе 1:5) и вновь инкубируют в термостате при 37°С в течение 45 мин. После инкубации комплемент сливают и проводят подсчёт образовавшихся бляшек (зон гемолиза). При относительно небольшом числе бляшек (примерно до 120 на чашку) их подсчитывают полностью. Если же бляшек больше, то их подсчёт производят следующим образом. В листе плотной чёрной бумаги вырезают отверстие в форме квадрата со стороной 1 см (т.е. площадью 1 см2 ). Подкладывая лист с вырезанным квадратом под донышко чашки, просчитывают выборочной число бляшек в 10 таких квадратах в разных участках чашки с последующим перерасчётом на всю поверхность агарозы в чашке (коэффициент перерасчёта для чашек диаметром 100 мм равен 6,88). Зная объём клеточной суспензии, наносимый на чашку, и общий объём селезёночной суспензии вычисляют количество бляшек (АОК) на всю селезёнку.

При статистической обработке полученных данных определяют среднюю геометрическую числа АОК, и стандартную ошибку. При сравнении результатов применяют критерий t Стьюдента. Достоверными считают различия при Р < 0,05 . При постановке экспериментов необходимо использовать не менее 6-10 животных в группе. Итоговые результаты являются суммарными показателями по крайней мере 2 опытов.

Реакцию Ерне можно заменить определением на 7 сутки после иммунизации титра антител в сыворотке крови мышей с помощью реакции гемагглютинации.

Список литературы:

Хаитов Р.М., Атауллаханов Р.И., Иванова А.С. и др. Методические указания по оценке иммунотоксического действия фармакологических веществ. — М., 2000.