Наши услуги
О нас
Доклинические исследования
Регламент
Видео доклинические исследования
Клинические исследования
Регламент
Клинические исследования видео
Набор добровольцев
Архив исследований
Набор пациентов
Новости медицины
Интервью
Архив новостей
Контакты
Вакансии
НАВЕРХ

Регламент

Исследование спонтанной и индуцированной митогенами пролиферации спленоцитов.

Исследование спонтанной и индуцированной митогенами пролиферации спленоцитов


Иммунотропные, митогенные, а в ряде случаев и аллергенные свойства исследуемых препаратов можно оценить с помощью реакции бласттрансформации лимфоцитов. Использование этого подхода с применением Т- и В-клеточных митогенов позволит также оценить преимущественное влияние фармпрепаратов на Т- или В- клеточные популяции лимфоцитов.

Постановка реакции. Животных опытных и контрольных групп забивают с помощью цервикальной дислокации, извлекают селезёнки и готовят клеточную суспензию при помощи стеклянного гомогенизатора. Полученные спленоциты отмывают средой 199 с 5% сыворотки крупного рогатого скота и по 200 мкл клеточной взвеси (с концентрацией 2х10/мл) в среде RPMI-1640 (Flow,Англия), дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, США), 0,01 М буфера HEPES (Gibco, США ), 200 мМ L-глутамина (Sigma, США),10 μМ 2-меркаптоэтанола (Merck,ФРГ), 100 мг/мл стрептомицина и 100 ед/мл пенициллина вносят в лунки 96-луночных планшетов. В часть лунок одновременно вносят митогены ( ФГА, ЛПС) в предварительно оттестированных концентрациях ( 10-20 мкг/мл). Контрольные лунки митогена не содержат. При наличии инъекционной или растворимой формы исследуемого препарата проводят оценку их митогенных свойств, помещая в различных концентрациях в лунки, содержащие спленоциты интактных животных. Внесение же препаратов в максимальной, не митогенной концентрации в культуру спленоцитов животных , получавших препарат, позволит судить о возможности сенсибилизации организма животных к препарату в случае повышения пролиферации при повторной контакте с препаратом спленоцитов животных опытных групп.

Затем селезеночные клетки инкубировали в течение 96 часов в атмосфере 5% СО 2  ,при температуре 37 5 º С и за 24 часа до окончания культивирования в лунки добавляли по 1 мкКи раствора  3Н-тимидина в объеме 10 мкл. Интенсивность включения  3Н-тимидина (число импульсов/мин) определяли в клетках, собранных с помощью Cell Harvester (Flow), на сцинтилляционном счетчике (Marck-III).

Уровень РБТЛ спленоцитов под влиянием митогенов или вносимых в среду культивирования препаратов оценивали по отношению к интенсивности РБТЛ спленоцитов в среде , не содержащей митогены или используемые препараты. Для оценки влияния препаратов на РБТЛ сравнивали величину включения  3Н-тимидина клетками селезенки мышей, получивших препараты, с таковой спленоцитов мышей, получивших физиологический раствор (ФР). Результаты выражают в значениях импульсов в минуту.

Список литературы:

Хаитов Р.М., Атауллаханов Р.И., Иванова А.С. и др. Методические указания по оценке иммунотоксического действия фармакологических веществ. — М., 2000.