Наши услуги
О нас
Доклинические исследования
Регламент
Видео доклинические исследования
Клинические исследования
Регламент
Клинические исследования видео
Набор добровольцев
Архив исследований
Набор пациентов
Новости медицины
Интервью
Архив новостей
Контакты
Вакансии
НАВЕРХ

Регламент

OECD, Test No403:2001 Оценка острой токсичности при ингаляционном поступлении

Введение

В настоящее время одним из основных путей поступления загрязнителей в организм является ингаляционный. Поэтому в комплексе исследований по воздействию химической продукции на организм человека изучение острой токсичности при вдыхании является ведущим.

Испытания острой ингаляционной токсичности призвано стать более гибким, направлено на сокращение использования животных и выполнение нормативных требований [4], [5]. Испытания острой ингаляционной токсичности содержат два вида исследования: Традиционный CL50 /LC50 протокол и Протокол Концентрация х Время (Протокол C*t) [1].

Главной особенностью является способность обеспечить отношения «концентрация-ответ» в диапазоне от не летального к летальному исходу, чтобы вывести среднюю летальную (CL50 /LC50), не летальную пороговую концентрацию (CL01/LC01), а также определить возможную гендерную чувствительность. Протокол C*t используется в особых регулятивных или научных интересах, которые требуют испытаний на животных в различные продолжительности воздействия, например, в целях планирования неотложного ответа реакции (получение значений Руководства по установлению уровней острого воздействия (AEGL), Руководства по планированию ответных

действий в чрезвычайных обстоятельствах (ERPG) или Американской испытательной лаборатории на воздействие загрязнителей на окружающую среду (AETL), территориального планирования.

Данные испытания позволяют охарактеризовать исследуемый препарат и дать количественную оценку его опасности, а также ранжировать и классифицировать вещество в соответствии с Согласованной на глобальном уровне системой классификации и маркировки химических веществ СГС(GHS) ООН.

 

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЯ ПО ВОЗДЕЙСТВИЮ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ НА ОРГАНИЗМ ЧЕЛОВЕКА.

Основные требования к проведению испытаний по оценке острой токсичности при ингаляционном поступлении.

Test for Acute Inhalation Toxicity

Дата введения - 201_-___ -__

Область применения

Настоящий стандарт устанавливает процедуру испытания химической продукции по оценке острой токсичности при ингаляционном поступлении в организм.

Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

Агония: состояние умирания или невозможности выжить даже при лечении [2].

Аэрозоль: Относительно стабильная во времени суспензия, газообразная среда, в которой рассредоточены мелкие твердые или жидкие частицы. Диаметр аэрозольных частиц составляет примерно от 0.001 до 100 |jm.

Гуманная конечная точка: гуманную конечную точку в испытаниях над животными можно определить как наиболее ранний показатель, указывающий на сильную боль, дистресс, страдания или приближающуюся гибель.

Дымка (или туман): жидкие аэрозоли, которые как правило, образуются путем конденсации пересыщенных паров или физической деформации жидкости: пульверизация, распыление или образование пузырьков. Густая дымка, затрудняющая видимость, называется туманом.

Испытание на предельное содержание: Ингаляционное исследование, выполненное с использованием единственной группы животных, которые были подвергнуты испытанию предельной концентрацией.

Концентрация: Масса тестируемого препарата на единицу объема воздуха (например, мг/л., мг/м3) или единица объема тестируемого препарата на единицу объема воздуха (напр., промилле, частей на млрд).

Острая ингаляционная токсичность: Вредный эффект, вызванный воздействием тестируемого препарата после непрерывной ингаляционной экспозиции на протяжении менее 24 часов. Продолжительность большинства исследований острой ингаляционной токсичности составляет 4 часа.

Пар: Фаза газообразного состояния исследуемого вещества, включая смеси, которые, как правило, находятся в жидком или твердом состоянии при комнатной температуре и давлении. Переход из газообразного состояния в жидкое зависит от баланса испарения и конденсации. Как следствие поверхностного натяжения, паровое давление больше для маленьких жидких капель нежели для плоских поверхностей (см. эффект Кельвина).

Предварительное исследование: предварительное изучение с использованием минимального количества животных для выбора концентраций, которые затем будут использоваться в главном исследовании.

Предельная возможная концентрация (предельная концентрация): Максимальная концентрация, рекомендуемая для исследований ингаляционной токсичности, которая зависит от физического состояния испытываемого препарата. Согласно Классификационной схеме СГС/GHS, предельная или максимально возможная концентрация составляет 20 000 ppm для газов, 20 мг/л для паров и 5 мг/л для аэрозолей.

Пыль: Сухие твердые частицы, рассредоточенные в газообразной среде в результате механического разрушения сыпучего материала или порошка, однокомпонентного или смеси. Частицы пыли, как правило, нерегулярны, диаметр их превышает 0,5 мкм.

Скорая гибель: Агония и смерть, которые ожидаются до наступления следующего запланированного наблюдения. Признаки, указывающие на такое состояние, у грызунов могут включать конвульсии, горизонтальное положение, опрокинутое положение и тремор [2].

Средний аэродинамический диаметр массы (MMAD): Среднемассовое распределение масс относительно аэродинамического диаметра. Средний аэродинамический диаметр и геометрическое стандартное отклонение используются для описания гранулометрического состава аэрозоля, основанного на массе и размере частиц аэрозольного облака. Масса пятидесяти процентов частиц будет меньше, чем средний аэродинамический диаметр массы, и 50 % частиц будут больше среднего аэродинамического диаметра. Для исследований острой ингаляционной токсичности рекомендуется MMAD в размере 1 - 4 µm.

СГС/GHS (Согласованная на глобальном уровне Система классификации и маркировки химических веществ): Система классификации химических веществ в зависимости от вида и уровня опасности для здоровья человека и окружающей среды, включающая согласованные элементы системы информирования, такие как пиктограммы , сигнальные слова , заявления об опасности , предупредительные заявления и спецификации по безопасности с целью передать информацию об опасности и защитить людей и окружающую среду. Сотрудничает с ОЭСР (здоровье человека и охрана окружающей среды), Комитетом экспертов по перевозке опасных грузов при ООН (физико - химические особенности) и Международной организации труда (МОТ) (система передачи информации о вредности) в рамках Межорганизационной программы по обоснованному управлению химическими веществами (IOMC).

CL50/LC50 (средняя смертельная концентрация): Обусловленная временем статистически выверенная оценка концентрации исследуемого вещества, которая предположительно может являться причиной смерти 50 % животных, подвергшихся определенному воздействию препарата во время экспозиции или в течение определенного промежутка времени после экспозиции. Значение CL50 /LC50 выражается как масса исследуемого препарата на единицу объема воздуха (мг/л, мг/м3) или как единица объема исследуемого препарата на единицу объема воздуха (промилле, частей на млрд). Продолжительность выдержки всегда должна быть установлена (например, четырех - часовая CL50 /LC50).

Описание метода

Принципы

Вся имеющаяся информация об исследуемом препарате должна находиться в распоряжении экспериментальной лаборатории до начала эксперимента в целях повышения качества исследования и минимизации количества привлеченных животных. Информация, которая может помочь при выборе подходящих для испытания концентраций, включает тождественность, химическую структуру и физико - химические свойства испытываемого вещества; результаты опытов на токсичность in vivo или in vitro; предполагаемая область применения и вероятность воздействия на человека; если имеются, то данные (Q)SAR и сведения о токсичности структурно родственных препаратов.

При изучении коррозионных и/или раздражающих продуктов следует избегать концентрации, которые могут вызвать сильную боль и страдания.

Коррозионный/раздражающий потенциал должен быть оценен при экспертизе имеющейся информации о воздействии на человека, экспериментальных животных, имеющихся данных в опытах in vitro, величине pH, информации для близких по структуре веществ или любых других данных с целью изучения целесообразности дальнейшего тестирования или его отмены.

При воздействии на животных целевые концентрации должны быть достаточно низкими для того, чтобы не вызвать боль или нарушения, и достаточно высокими для того, чтобы расширить кривую «концентрация - ответ» до уровней, которые соответствуют нормативным и научным целям исследования. Данные концентрации должны быть выбраны отдельно в каждом случае; выбор концентрации должен быть обоснован.

Испытания призваны обеспечить получение информации об острой токсичности исследуемого препарата с целью его классификации и получения данных о летальности (CL50/LC50, CL01/LC01) для одного или обоих полов, как необходимо для определения количественной оценки риска. Предлагается два метода проведения испытаний. Первый метод - Традиционный протокол, где группы животных подвергаются воздействию предельной концентрации (тест на предельную концентрацию) или серии концентраций поэтапно в заранее установленную продолжительность времени; она составляет менее 24 часов (как правило, 4 часа). Второй метод - протокол Концентрация * Время (C*t), применяется в группах животных, которые подвергаются воздействию одной концентрации (тест на предельно допустимую концентрацию) или серии концентраций при различной продолжительности времени.

Агонизирующие животные или животные, очевидно испытывающие боль или демонстрирующие признаки страдания и истощения, должны быть гуманно умерщвлены, если нет веских оснований для другого (такие причины должны быть отражены в отчете по исследованию). Агонизирующие животные рассматриваются как животные, погибшие во время испытания. Критерии для принятия решения об умерщвлении агонизирующих или тяжело страдающих животных, а также определение признаков прогнозируемой или приближающейся смерти.

Животные

Выбор вида

Следует использовать молодых здоровых особей из обычно используемых лабораторных линий. Предпочтительно использовать крыс. В случае использования других видов необходимо привести обоснование.

Подготовка

Самки должны быть нерожавшими и небеременными. На день экспозиции испытываемого препарата животные должны быть в возрасте от 8 до 12 недель, диапазон колебания массы животных для каждого пола не должен превышать ± 20 % от средней массы животных, участвовавших в предыдущем испытании, в такой же отрезок времени. Животные отбираются в случайном порядке и маркируются, что позволит идентифицировать каждое из них. Животных следует содержать в клетках в течение не менее пяти дней до начала испытания, чтобы позволить им адаптироваться к лабораторным условиям. Животным также необходимо дать короткое время приспособиться к исследуемому прибору до начала испытания с целью уменьшить стресс от попадания в новую среду.

Содержание

Температура в помещении, где содержатся экспериментальные животные, должна составлять (22±3) °С, оптимальный уровень относительной влажности от 30 до 70 %. В исследовании одного уровня концентрации животных можно поместить в одну камеру, но число животных в камере не должно затруднять возможность наблюдать за каждым из них, а также должно сократить вероятность потерь из - за каннибализма и борьбы. Свойства исследуемого препарата или токсичность (способность вызывать заболевание, возбуждать ЦНС) могут указывать на необходимость содержания животного в индивидуальной камере, чтобы предотвратить каннибализм. Допустимо использование стандартных лабораторных режимов питания, за исключением периода экспозиции испытываемого препарата, во время которого для животного необходимо обеспечить неограниченное потребление питьевой воды. Освещение должно быть искусственным в режиме 12 часов при свете/12 часов в темноте.

Ингаляционные камеры

При выборе ингаляционной камеры следует учитывать природу исследуемого препарата и нормативные требования. По умолчанию используется интраназальная модель экспозиции (данный термин включает в себя воздействие только через голову, только через нос и только через мордочку). Экспозиция только через нос предпочтительна для изучения аэрозолей жидких и твердых и для паров, которые могут конденсироваться в форме аэрозолей. При этом для решения отдельных задач исследования целесообразно применять воздействие через все тело. Использование другой модели экспозиции помимо той, что применяется по умолчанию, должно быть обусловлено целями исследования и обосновано в отчете.

Для обеспечения атмосферы стабильности при использовании камеры объем, занимаемый телами тестируемых животных, не должен превышать 5 % объема камеры.

Условия экспозиции

Введение концентраций

Воздействие только через нос на крысах может длиться до 6 часов. Если подопытные животные - мыши, период выдержки не должен превышать 4 часов. Если требуется более длительный период экспозиции, необходимо привести обоснования. Животных, которые подвергаются воздействию препарата в камерах на все тело, следует содержать по отдельности, чтобы предотвратить проглатывание исследуемого препарата соседями по камере во время чистки. Пища во время экспозиции не дается. Воду можно давать в течение всего времени экспозиции на все тело.

Животные могут подвергаться воздействию исследуемого препарата в виде газа, паров, аэрозоля или их смеси. Исследуемое физическое состояние зависит от физико-химических свойств тестируемого препарата, выбранной концентрации и/или физической формы, которые наиболее приближены к реальным условиям использования изучаемого продукта. Гигроскопичный и химически реактивный препарат следует тестировать в условиях минимальной влажности, в отсутствии паров воды. Особое внимание следует уделять тому, чтобы не создавать взрывоопасные концентрации.

Гранулометрический состав

Определение размера частиц необходимо для всех аэрозолей и всех паров, которые могут конденсироваться и превращаться аэрозоль. Чтобы обеспечить воздействие на все важные области дыхательных путей, рекомендуется использование аэрозоля с массовым средним аэродинамическим диаметром (MMAD) в диапазоне от 1 до 4 мкм с геометрическим стандартным отклонением (Ig) в диапазоне от 1,5 до 3,0. В случае, если данное требование невозможно соблюсти, необходимо предоставить экспертную оценку. Например, металлические частицы в воздухе могут быть меньшего размера, чем стандартные, также заряженные частицы, волокна и гигроскопичные материалы (которые увеличиваются в размерах во влажной среде в респираторном тракте) могут превышать размер стандартных.

Растворитель можно использовать для создания необходимой концентрации и размера частиц исследуемого препарата в атмосфере. Как правило, в качестве растворителя предпочтительней использовать воду. Зернистый материал может быть подвергнут механическим процессам, чтобы добиться требуемого гранулометрического состава, при этом необходимо позаботиться о том, чтобы состав исследуемого препарата не разложился и не изменился. Если есть опасение, что в результате механических процессов состав тестируемого препарата претерпит изменения (например, чрезмерно высокая температура в процессе сильного дробления вследствие трения), то состав тестируемого препарата необходимо проверить при помощи анализа. При этом необходимо проследить, чтобы не занести в препарат загрязняющие вещества.

Контрольные животные

В параллельном использовании отрицательных (воздухом) контрольных групп необходимости нет. В случае, если для получения нужной концентрации испытываемого вещества в воздухе используется какой - либо растворитель, помимо воды, то контрольную группу следует использовать только в случае отсутствия справочных данных о токсичности растворителя при ингаляционном воздействии. Если исследование токсичности препарата, содержащего растворитель, показывает отрицательный результат, то из этого следует, что растворитель нетоксичен при исследуемых концентрациях; следовательно, в испытании растворителя нет нужды.

Воздушные потоки в камере

Воздушные потоки, проходящие через камеру, необходимо тщательно контролировать, непрерывно наблюдать и фиксировать по меньшей мере раз в час на протяжении всего периода выдержки. Наблюдение за концентрацией исследуемого вещества в газовой среде (или устойчивостью) представляет собой интегральное вычисление всех динамических параметров и обеспечивает косвенные способы контроля всех значимых параметров для формирования динамической атмосферы. Необходимо избегать возвратного дыхания в камерах, предназначенных для воздействия через нос в случаях, когда воздушные потоки через установку экспонирования недостаточны для динамических потоков исследуемого вещества в газовой среде. Существуют методы, при помощи которых можно установить, что возвратное дыхание при данных условиях эксперимента не имеет места. Концентрация кислорода должна составлять не менее 19 %, концентрация углекислого газа - не менее 1 %. Если есть основание полагать, что эти требования не удовлетворяются, концентрации кислорода и углекислого газа необходимо измерить.

Температура и относительная влажность в камере

Температура в камере должна составлять (22±3) °С. Относительную влажность в зоне дыхания животных, находящихся в камерах, предназначенных, как для воздействия только через нос, так и через все тело, необходимо наблюдать и фиксировать не менее трех раз в течение периода выдержки. Идеальная относительная влажность составляет 30 % - 70 %, но в определенных случаях (например, тестирование препарата на водной основе) данный уровень может быть неприменим или неизмеряем вследствие взаимовлияния исследуемого препарата и метода исследования.

Исследуемый препарат:

Номинальная концентрация

По возможности следует наблюдать и фиксировать номинальную концентрацию при экспозиции в клетке. Номинальная концентрация - это масса сгенерированного испытываемого вещества, разбавленная общим объемом воздуха, проходящего через систему клетки. Номинальная концентрация не используется при описании экспозиции на животных, но сравнение номинальной и фактической концентраций позволит судить об эффективности генератора в испытательной системе и позволит вовремя выявить проблемы в нем.

Фактическая концентрация

Фактическая концентрация - это концентрация исследуемого препарата в зоне дыхания животных в ингаляционной камере. Фактическая концентрация может быть получена специальными методами (например, методом непосредственного выбора, адсорбционным методом или методом химической реактивности, и последующим анализом) или неспециальными методами (например, гравиметрический капельный анализ). Использование гравиметрического анализа допустимо только для однокомпонентных порошкообразных веществ в аэрозольной упаковке или для жидких аэрозолей с невысокой летучестью и должно быть подкреплено предварительно полученными соответствующими специальными характеристиками исследуемого препарата. Концентрацию аэрозоля с многокомпонентным порошком можно также определить с помощью метода гравиметрического анализа. В этом случае потребуются данные анализа, подтверждающие, что состав аэрозольного препарата аналогичен составу исходного материала. Если подобной информации не имеется, может потребоваться повторный анализ исследуемого вещества (в воздухе) в определенные временные интервалы в течение исследования. Для аэрозольных агентов, которые могут испаряться или сублимироваться, необходимо указать, что для сбора всех этапов был использован выбранный метод. Цели, номинальная и фактическая концентрации должны быть указаны в отчете исследования, но в статистическом анализе для подсчета значения смертельной концентрации используется только фактическая концентрация.

Необходимо использовать только один препарат для тестирования, если это возможно, и исследуемый образец должен храниться в условиях, которые позволят сохранить его чистоту, однородность и стабильность. Перед началом исследования необходимо располагать описанием препарата, включая степень его чистоты и, если это технически возможно, указать и количество выявленных в нем примесей. Такие сведения можно наглядно показать с помощью следующих, но не ограничиваясь ими, данных: времени удержания и относительной площади пика, молекулярной массы, полученной методом масс - спектроскопии или газовой хроматографии и т.п. Хотя определение тестовых образцов не входит в обязанности испытательной лаборатории, возможно, целесообразно подтвердить поддерживающие характеристики, по крайней мере, в ограниченном виде (цвет, физическая природа и т.д.).

Воздушную среду нужно поддерживать максимально постоянной и проверять непрерывно и/или регулярно в зависимости от метода анализа. При регулярном контроле образцы проб атмосферы в камере нужно забирать не реже двух раз в 4 часа во время исследования.

Если это невозможно вследствие ограниченных воздушных потоков или низкой концентрации, за все время проведения исследования допускается отбор одной пробы. Если образцы демонстрируют разные показатели, для следующих исследуемых концентраций нужно забирать четыре образца/экспозицию. Образцы концентрации для каждой камеры не должны отклоняться от средней концентрации более чем на ± 10 % для газов и паров или ± 20 % для жидких и твердых аэрозолей. Время для достижения равновесного состояния и перехода к распаду (t95) нужно измерить и зафиксировать. Период воздействия охватывает время генерации исследуемого вещества. При этом учитывается время, необходимое для достижения равновесного состояния в камере (t95) и перехода к распаду.

Сложные смеси из газов/паров и аэрозолей (атмосфера горения и тестируемый препарат, выталкиваемые из программного изделия/прибора конечного пользователя) на каждом этапе могут демонстрировать разное поведение в ингаляционной камере, поэтому по меньшей мере одна индикаторная субстанция (аналит), как правило, основная активная в исследуемом препарате, должна быть выбрана на всех этапах (газ/пар или аэрозоль). Когда тестируемый препарат является смесью (по составу), аналитическая концентрация должна быть описана для общего состава, а не только для активного ингредиента или компонента (вещества, определяемого при анализе).

Гранулометрической состав аэрозолей должен определяться не менее двух раз за 4 часа выдержки при помощи каскадного импактора (пробоотборник частиц) или альтернативным инструментом (например, аэродинамическим спектрометром (APS)). Гравиметрический фильтр или импинджер (прибор для измерения запыленности и загазованности) нужно использовать для подтверждения эффективности работы основного прибора, используемого для определения гранулометрического состава исследуемого вещества. Массовая концентрация, полученная ситовым анализом, должна находиться в разумных пределах массовой концентрации, полученной в результате анализа работы фильтров. Если удастся показать равнозначность результатов, полученных каскадным импактором и альтернативным инструментом, то допускается использование альтернативного инструмента в исследовании. Размеры частиц должны быть определены для паров, если есть вероятность, что их конденсация приведет к образованию аэрозоля, или если в парах обнаружены частицы с потенциалом смешанных фаз.

Процедура испытания

Существует два вида исследования: Традиционный протокол и Протокол C*t. Оба включают визуальное наблюдение, основное исследование и/или тест на предельное содержание. Если данные показывают, что один пол восприимчивей другого, Лицо, ответственное за проведение неклинического исследования в области медицинской и экологической безопасности от начала до конца.руководитель исследования может предпочесть продолжить испытание с более восприимчивым полом. Если грызуны, за исключением крыс, подвергаются воздействию только через нос, то максимальный период экспозиции должен минимизировать видоспецифические различия. Перед тем как начать, все имеющиеся данные необходимо рассмотреть, чтобы минимизировать количество вовлеченных в эксперимент животных.

Традиционный протокол

Общие положения

В Традиционном протоколе группы животных подвергаются воздействию препарата определенный период времени (как правило, 4 часа) в камерах, предназначенных для воздействия только при вдыхании через все тело. Животных подвергают испытанию предельной концентрацией или испытанию воздействием трех концентраций поэтапно (основное исследование). Основному исследованию предшествует предварительное, за исключением случаев, когда информация о тестируемом веществе имеется.

Предварительное исследование

Предварительное исследование используется для оценки эффективности исследуемого препарата, для определения различий в гендерной восприимчивости и помогает выбрать уровень концентрации для экспозиции в основном исследовании или в тесте на предельную концентрацию. При выборе уровня концентрации для предварительного исследования нужно использовать всю имеющуюся информацию, включая данные QSAR, схожих химикатов. Воздействию каждого уровня концентрации должны быть подвержены не более трех самцов и трех самок (три животных/пол может понадобиться для того, чтобы установить различие в гендерной восприимчивости). Предварительное исследование может быть ограничено наблюдением за одним уровнем концентрации, но при необходимости можно включить больше концентраций. В предварительном исследовании не следует использовать такое же большое количество животных и концентраций, как в основном. Вместо предварительного исследования допустимо использовать результаты ранее выполненного исследования.

Выбор предельной концентрации как правило зависит от нормативных требований. При использовании Классификационной системы СГС предельная (максимально разрешенная) концентрация для газов, паров и аэрозолей составляет 20,000 промилле, 20 мг/л и 5 мг/л соответственно. Генерация предельных концентраций для некоторых препаратов, особенно для паров и аэрозолей, может быть технически затруднена. При испытании аэрозоля целью является получение размеров частиц, пригодных для вдыхания (MMAD - от 1 до 4 |jm) при предельной концентрации 2 мг/л. Такое возможно с большинством исследуемых препаратов. Тестирование аэрозоля при предельной концентрации больше чем 2 мг/л нужно осуществлять только в случае, если величина частиц пригодна для вдыхания. СГС не одобряет испытаний на излишне высоких предельных концентрациях из соображений заботы о животных. Предельная концентрация может быть превышена только по исключительно веской причине (охрана здоровья человека), в таких случаях причина должна быть отражена в отчете. В случае если тестируемый продукт потенциально взрывоопасен, нужно избегать условий, благоприятных для взрыва. Чтобы избежать ненужного использования животных, перед испытанием предельной концентрации необходимо провести пробный тест, чтобы удостовериться, что в камере обеспечены условия для проведения теста с предельной концентрацией.

Если при испытании с предельной концентрацией наблюдаются смертность или агония, результаты испытания могут заменить предварительное исследование при испытаниях других концентраций (раздел 4.1.3). Если физические или химические свойства исследуемого препарата не позволяют достичь уровня предельной концентрации, нужно исследовать максимально достижимую концентрацию. Если при испытании максимально достижимой концентрации летальность составляет более 50 %, дальнейшее исследование не требуется. Отчет по исследованию должен содержать пояснения и данные, обосновывающие, почему невозможно достичь уровня предельно допустимой концентрации. Если максимально достижимая концентрация паров не вызывает токсического эффекта, необходимо сгенерировать исследуемый препарат в виде жидкого аэрозоля.

Основное исследование:

Основное исследование, как правило, выполняется с использованием пяти самцов и пяти самок (или пять животных наиболее восприимчивого пола, если таковой известен) на каждый уровень концентрации. Для проведения достоверного статистического анализа нужно использовать достаточный уровень концентрации. Временной интервал между тестами в подопытных группах определяется появлением, длительностью и тяжестью токсических признаков. Экспозицию последующего уровня концентрации нужно отложить, пока не появится уверенность в том, что прошедшие испытание животные выживут. Это позволит руководителю исследования скорректировать целевую концентрацию для следующей подопытной группы. Такое в ингаляционных исследованиях не всегда может быть практичным из - за зависимости от сложных современных технологий, поэтому экспозиция на животных следующего уровня концентрации должна основываться на предыдущем опыте и научном суждении.

Протокол Концентрация х Время (Сˣt)

Общие положения

Пошаговое исследование Концентрация * Время (C*t) может быть рассмотрена как альтернатива Традиционному протоколу при оценке ингаляционной токсичности. Такой подход позволит подвергнуть животных воздействию нескольких уровней концентрации исследуемого вещества и многочисленным периодам воздействия. Все испытания проводятся в камере, предназначенной для воздействия через нос (камеры для воздействия через все тело не используются в настоящем протоколе). Результатом исследований в соответствии с традиционным протоколом и протоколом C*t являются значения CL50/LC50, но испытания по протоколу C*t предпочтительней для получения значений CL01/LC01 и CL10/LC10.

Исследование методом моделирования показало, что использование двух животных в установленном интервале C*t (по одному каждого пола или два наиболее восприимчивого пола) может быть целесообразным при испытании четырех или пяти концентраций в основном исследовании. В некоторых случаях руководитель исследования может решить использовать по две крысы каждого пола на интервал C*t. Использование двух животных каждого пола на каждый уровень концентрации/момент времени может уменьшить систематическую ошибку оценки и изменчивость, увеличить коэффициент результативности и улучшить охват доверительного интервала. Тем не менее, в случае неполного использования данных (при использовании по одному животному каждого пола или двух наиболее восприимчивого пола) пятой экспозиции может быть достаточно.

Предварительное исследование

Также как и в Традиционном протоколе, предварительное исследование может предшествовать основному исследованию или испытанию предельной концентрации для оценки эффективности испытываемого вещества, определения гендерных различий в чувствительности и помощи в выборе уровня концентрации для экспозиции в основном исследовании. При выборе уровня концентрации для предварительного исследования нужно использовать всю имеющуюся информацию, включая структурно- активные отношения и данные о близких по структуре веществах. Воздействию каждого уровня концентрации должны быть подвержены не более трех самцов и трех самок (это количество может понадобиться для того, чтобы установить различие в гендерной восприимчивости). Животных нужно подвергнуть воздействию одной продолжительности, как правило, на 240 мин. Вместо предварительного исследования допустимо использование результатов ранее выполненного исследования.

Испытание начальной концентрации (Сˣt протокол)

Начальная концентрация может быть предельной концентрацией или концентрацией, выбранной руководителем исследований на основании предварительных исследований.

Группы 1 животное/пол подвергаются воздействию этой концентрации в течение различной продолжительности времени (например, 15, 30, 60, 120 или 240 мин), всего общее количество животных - 10 (Экспозиционная сессия I, пункт 4.2.5.2).

Выбор предельной концентрации, как правило, зависит от нормативных требований. При использовании Классификационной системы СГС (GHS) предельная концентрация для газов, паров и аэрозолей составляет 20,000 промилле, 20 мг/л и 5 мг/л соответственно (или максимально разрешенная концентрация). Генерация предельных концентраций для некоторых препаратов, особенно для паров