Наши услуги
О нас
Доклинические исследования
Регламент
Видео доклинические исследования
Клинические исследования
Регламент
Клинические исследования видео
Набор добровольцев
Архив исследований
Набор пациентов
Новости медицины
Интервью
Архив новостей
Контакты
Вакансии
НАВЕРХ

Регламент

Глава 5.2. Анализ экспрессирующей конструкции клеток, используемых в производстве белковых препаратов, полученных по технологии рекомбинантной ДНК

1. Область применения

Настоящая глава содержит указания по определению характеристик экспрессирующей конструкции, предназначенной для синтеза белковых препаратов по технологии рекомбинантной ДНК в эукариотических и прокариотических клетках и данные, важные для оценки структуры экспрессирующих конструкций, используемых в производстве белков на основе рекомбинантной ДНК. Рассмотрение всех аспектов качества лекарственных препаратов, полученных по технологии рекомбинантной ДНК, не является целью настоящей главы.

Экспрессирующая конструкция – экспрессирующий вектор, содержащий последовательность, кодирующую рекомбинантный белок. Для обеспечения качества и постоянства свойств лекарственного препарата следует анализировать области экспрессирующих конструкций с использованием методов изучения нуклеиновых кислот в сочетании с подходами, применяемыми для анализа очищенных рекомбинантных белков.

Анализ экспрессирующих конструкций на уровне нуклеиновых кислот является элементом целостного процесса оценки качества, при этом в таком исследовании оценивается только кодирующая последовательность рекомбинантного гена, но не точность трансляции или другие характеристики рекомбинантного белка, например, вторичная, третичная структуры и посттрансляционные модификации.

2. Обоснование анализа экспрессирующей конструкции

Цель анализа экспрессирующей конструкции – подтвердить, что в клетку-хозяина внедрена правильная кодирующая последовательность продукта и она поддерживается в ней в течение культивирования до окончания производственного процесса. Генетическая последовательность рекомбинантных белков, синтезируемая в живых клетках, может подвергаться мутациям, способным изменить свойства белка, что может привести к негативным последствиям у пациентов. Ни один экспериментальный подход не позволяет выявить одновременно все возможные модификации белков.

Для изучения аминокислотной последовательности и структурных особенностей экспрессирующегося белка, обусловленного посттрансляционными модификациями, например, протеолитическим процессингом, гликозилированием, фосфорилированием и ацетилированием, допускается использование методов белкового анализа.

Белковый анализ может не выявить все изменения структуры рекомбинантного белка, обусловленные мутациями в кодирующей его последовательности. В этом случае данные анализа нуклеиновых кислот могут представлять особое значение. Относительная важность анализа нуклеиновых кислот и белков для разных препаратов различается. Анализ нуклеиновых кислот можно применять для верификации кодирующей последовательности, а также для оценки физического состояния экспрессирующей конструкции.

Анализ нуклеиновых кислот проводят, чтобы убедиться, что экспрессируемый белок имеет правильную аминокислотную последовательность, однако этот метод не предназначен для обнаружения малых количеств вариантных последовательностей.

Если клетки-продуценты содержат множество встроенных копий экспрессирующей конструкции, не все из которых транскрибируются, наиболее подходящим методом может быть исследование самих продуктов транскрипции при помощи анализа мРНК или кДНК, а не исследование геномной ДНК. Аналитические подходы, направленные на изучение всей совокупности нуклеиновых кислот, например, проводимые на пуле клонов или материале, амплифицированном при помощи полимеразной цепной реакции, можно рассматривать как альтернативу методам, зависящим от отбора отдельных клонов ДНК. Возможно использование других методик, позволяющих быстро и с достаточной чувствительностью верифицировать в экспрессирующей конструкции последовательность, кодирующую рекомбинантный белок.

В настоящей главе описываются данные, которые следует учитывать при составлении характеристики экспрессирующей конструкции в процессе разработки и валидации производственного процесса. Аналитические методики должны пройти валидацию для подтверждения способности обнаружения последовательности. Валидационная Записи в любой форме описывающие, либо регистрирующие методы, организацию и/или результаты доклинического (неклинического) исследования, факторы, влияющие на исследование и принятые меры, оформленная в установленном порядке.документация должна по меньшей мере включать расчет пределов обнаружения вариантных последовательностей, для этого необходимо провести валидацию методик секвенирования нуклеиновых кислот либо белков. Принципы и рекомендации по анализу, описанные в настоящей главе, необходимо регулярно пересматривать для учета новых технических достижений и научных данных.

3. Установление характеристик экспрессирующей системы

3.1. Экспрессирующая конструкция и клон клеток, использованные для создания главного банка клеток

Производитель должен описать происхождение нуклеотидной последовательности, кодирующей белок. Это описание должно включать идентификацию и источник клеток, из которых получена последовательность нуклеотидов была исходно. Необходимо приложить описание методов, применявшихся для получения ДНК, кодирующей белок. Необходимо представить подробное описание этапов сборки экспрессирующей конструкции. Это описание должно включать источник и функцию компонентов конструкции, например, ориджинов (точек начала) репликации, генов антибиотикорезистентности, промоторов, энхансеров, а также является ли белок продуктом слияния (химерным).

Необходимо представить подробную карту компонентов и полную последовательность плазмиды с указанием участков, секвенированных в ходе создания конструкции, и участков, последовательность которых была взята из литературных данных. Необходимо указать другие экспрессирующиеся белки, кодируемые этой плазмидой. При помощи секвенирования ДНК необходимо определить нуклеотидную последовательность участка, кодирующего целевой ген, а также связанные с ним фланкирующие области, введенные в вектор, включая области в точках лигирования. Следует представить описание метода введения экспрессирующей конструкции в клетку-хозяина. Кроме того, необходимо подробно описать методы, использованные для амплификации экспрессирующей конструкции, и критерии отбора клона клеток в качестве будущего продуцента.

3.2. Система банков клеток

Для синтеза рекомбинантных белков необходимо использовать только надлежащим образом охарактеризованные ГБК и РБК. Банк клеток представляет собой комплект хранящихся в определенных условиях контейнеров одинакового состава, каждый из которых содержит аликвоту, отобранную из одного и того же пула клеток. ГБК обычно получают из отобранного клона клеток, содержащего экспрессирующую конструкцию. РБК получают, культивируя клетки из одного или нескольких контейнеров ГБК.

В регистрационном досье необходимо подробно описать процесс получения клеточной линии и формирования банка клеток, включая методы и реагенты, применявшиеся при культивировании, клеточный возраст in vitro и условия хранения. Во всех банках клеток должно быть определено наличие значимых генотипических и фенотипических маркеров, которые могут включать экспрессию рекомбинантного белка и наличие экспрессирующей конструкции. Экспрессирующую конструкцию в ГБК следует анализировать согласно приведенной ниже последовательности испытаний.

Если такой анализ на ГБК провести невозможно, его необходимо выполнить на каждом из рабочих банков. Для определения числа копий экспрессирующей конструкции, выявления в ней инсерций или делеций, а также для установления числа участков интеграции следует применять картирование с использованием рестрикционных эндонуклеаз или другие подходящие методы.

Для внехромосомных экспрессирующих систем следует определить процент клеток хозяина, сохраняющих экспрессирующую конструкцию. Необходимо подтвердить (верифицировать) правильность последовательности экспрессирующей конструкции, кодирующей рекомбинантный белок. Для внехромосомных экспрессирующих систем следует изолировать экспрессирующую конструкцию и верифицировать нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, не проводя дальнейшее клонирование. Для клеток с хромосомными копиями экспрессирующей конструкции нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, следует подтверждать с помощью повторного клонирования и секвенирования хромосомных копий.

В качестве альтернативного варианта нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, можно верифицировать секвенированием пула клонов кДНК или материала, амплифицированного с помощью полимеразной цепной реакции. Кодирующая последовательность должна быть идентична (в границах предела обнаружения используемой методики) последовательности, требуемой для экспрессирующей конструкции, описанной в подразделе 3.1 настоящей главы, кроме того, она должна соответствовать ожидаемой аминокислотной последовательности белка.

3.3. Предельный для производства клеточный возраст in vitro

Предельный для производства клеточный возраст in vitro необходимо устанавливать на основе данных, полученных при культивировании клеток-продуцентов до предлагаемого клеточного возраста in vitro или в течение большего периода времени в рамках опытно-промышленного или промышленного производства.

Как правило клетки-продуценты получают, культивируя клетки из РБК, тогда как ГБК для подготовки клеток-продуцентов следует применять только при надлежащем обосновании. Экспрессирующую конструкцию клеток-продуцентов в ГБК необходимо проанализировать однократно (в соответствии с требованиями подраздела 3.2 настоящей главы).

Последовательность экспрессирующей конструкции, кодирующей белок, в клетках- продуцентах может быть проверена при помощи анализа нуклеиновых кислот или анализа готового белкового препарата. Ранее установленный предельный для производства клеточный возраст in vitro можно увеличивать, только основываясь на данных, полученных на клетках, культивированных до клеточного возраста in vitro, равного или превышающего новый предельный клеточный возраст in vitro.

4. Заключение

Определение характеристик экспрессирующей конструкции и готового очищенного белка – важные этапы обеспечения постоянства производства препарата, изготавливаемого по технологии рекомбинантной ДНК. Оценка аналитических данных, полученных по результатам анализа нуклеиновых кислот и готового очищенного белка, необходима для обеспечения надлежащего качества рекомбинантных белковых препаратов.

5. Определения

Для целей настоящей главы используются понятия (термины), которые означают следующее:

  • «значимые генотипические и фенотипические маркеры» – маркеры, позволяющие идентифицировать штамм клеточной линии. Они должны включать экспрессию рекомбинантного белка или наличие экспрессионной конструкции;
  • «клеточный возраст in vitro» – период с момента оттаивания контейнеров с ГБК до сбора препарата в производственной емкости, измеряемый по продолжительности времени культивирования, степени удвоения популяции клеток или по числу пассажей клеток при субкультивировании с использованием определенной процедуры разведения культуры;
  • «опытно-промышленное производство» – получение рекомбинантного белка при помощи технологических процессов, полностью повторяющих или имитирующих полномасштабное промышленное производство. Методы культивирования клеток, сбора продукта и его очистки должны быть идентичными, за исключением масштаба производства;
  • «сайт интеграции» – участок, в котором в геном клетки встраивается одна или несколько копий экспрессирующей конструкции;
  • «фланкирующие контрольные области» – некодирующие нуклеотидные последовательности, прилегающие к 5′- и 3′-концам последовательности нуклеотидов нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт. Фланкирующие контрольные области содержат важные элементы, влияющие на транскрипцию, трансляцию или стабильность кодирующей последовательности. Эти участки включают, например, промотор, энхансер и сплайсинговые последовательности и не содержат ориджины репликации и генов антибиотикорезистентности;
  • «экспрессирующая конструкция» – экспрессирующий вектор, содержащий последовательность, кодирующую рекомбинантный белок, и элементы, необходимые для ее экспрессии.