Наши услуги
О нас
Доклинические исследования
Регламент
Видео доклинические исследования
Клинические исследования
Регламент
Клинические исследования видео
Набор добровольцев
Архив исследований
Набор пациентов
Новости медицины
Интервью
Архив новостей
Контакты
Вакансии
НАВЕРХ

Регламент

Глава 5.1. Производство и контроль качества биотехнологических лекарственных препаратов, полученных методом рекомбинантной ДНК

1. Область применения

Исследования в области молекулярной генетики и химии нуклеиновых кислот сделали возможными выявление, детальный анализ, передачу между организмами и экспрессию при заданных условиях (для синтеза полипептидов) генов, кодирующих естественные, биологически активные белки. Многие лекарственные препараты, которые ранее было трудно получить из природных источников, сегодня можно получать с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Кроме того, возможность синтезировать нуклеиновые кислоты и осуществлять над ними манипуляции позволяет конструировать гены, кодирующие модифицированные продукты, обладающие отличными от их природных аналогов свойствами, или даже принципиально новые продукты.

Общая стратегия при разработке препаратов с помощью технологии рекомбинантной ДНК – внедрение естественных, или намеренно модифицированных естественных последовательностей или новых нуклеотидных последовательностей в вектор, вводимый в подходящий организм-хозяин, для обеспечения эффективной экспрессии целевого продукта.

В настоящее время разработаны и применяются прокариотические и эукариотические экспрессирующие системы «вектор/клетка-хозяин». На экспрессию чужеродных генов, вводимых в новый организм с помощью подходящего вектора, влияет комплекс факторов, поэтому важным аспектом разработки препарата является стабильная управляемая экспрессия клонированных ДНК-последовательностей.

В целях контроля качества этих препаратов необходимо придерживаться гибкого подхода, чтобы по мере накопления опыта производства и применения, а также вследствие разработки новых технологий, выполнять модификацию приведенных требований. Выполнение этих требований в отношении отдельных препаратов должно отражать их предполагаемое клиническое применение.

Цель данной главы – упростить сбор и представление данных, в составе регистрационного досье лекарственных препаратов на основе полипептидов, получаемых по технологии рекомбинантной ДНК и предназначенных для медицинского применения в Союзе. Требования настоящей главы связаны также с требованиями других актов в сфере обращения лекарственных средств, входящих в право Союза.

2. Вопросы производства

Производители лекарственных препаратов, получаемых по технологии рекомбинантной ДНК, должны соответствовать требованиям, предъявляемым правилами надлежащей производственной практики Союза, утверждаемых Комиссией, законодательству государств-членов о генетически модифицированных организмах, а также соответствовать общим требованиям по контролю качества биологических лекарственных препаратов.

Необходимо обеспечить должное качество всех реагентов, используемых при производстве лекарственных препаратов, включая компоненты среды культивирования, спецификации на них необходимо включить в регистрационное досье, они должны соответствовать всем действующим требованиям, установленным актами, входящими в право Союза, (например, требованиям по минимизации риска передачи возбудителя губчатой энцефалопатии через лекарственные препараты). Соответствующие спецификации следует включать в регистрационное досье на лекарственный препарат. Испытания на активность, пирогены, стерильность и т. д., проводимые на препаратах, получаемых с помощью традиционных методов, также применимы к препаратам, получаемым по технологии рекомбинантной ДНК.

При производстве препаратов не рекомендуется использовать агенты, способные вызывать сенсибилизацию у некоторых лиц (например, пенициллин или другие β-лактамные антибиотики). Несмотря на важность всесторонней характеристики лекарственного препарата, следует уделить большое внимание внутрипроизводственному контролю. Эта концепция доказала свою высокую эффективность при контроле качества бактериальных и вирусных вакцин, произведенных традиционными способами.

Некоторые факторы могут негативным образом отразиться на постоянстве качества, безопасности и эффективности препаратов, полученных по технологии рекомбинантной ДНК, поэтому таким факторам следует уделить особое внимание. При этом необходимо учитывать следующее: все биологические системы претерпевают генетические изменения посредством мутаций и селекции, а чужеродные гены, вводимые в новые клетки хозяина, могут проявлять повышенную генетическую нестабильность.

Цель молекулярно-генетических исследований показать, что правильная последовательность была получена и введена в клетку хозяина и что структура и число копий введенной последовательности остаются в клетке неизменными в ходе культивирования до завершения производства. Такие исследования могут дать значимую информацию, которую следует рассматривать в сочетании с результатами исследований целевого белка для обеспечения качества и постоянства свойств препарата; целевые продукты, экспрессируемые чужеродными клетками- продуцентами, могут структурно, биологически или иммунологически отличаться от своих природных аналогов. Такие изменения могут возникнуть на посттрансляционном уровне или в ходе производства либо очистки и приводить к нежелательным клиническим последствиям. Должно быть показано, что наличие этих изменений допустимо, то есть не приводит к проявлению нежелательных клинических эффектов.

В связи с этим присутствие целевых продуктов с такими изменениями необходимо обосновать и подтвердить наличие постоянного контроля; выбор технологии производства влияет на свойства, разнообразие и количество потенциальных примесей в лекарственном препарате, а также определяет, в отношении каких процессов очистки необходимо подтверждать способность этих процессов элиминировать примеси (например, эндотоксины в препаратах, получаемых в бактериальных клетках, посторонние агенты и ДНК в препаратах, получаемых в клетках млекопитающих); нежелательная изменчивость культуры в ходе производства может привести к изменениям, благоприятствующим экспрессии других генов в системе «хозяин-вектор», или вызывающим нарушения свойств препарата. Такая изменчивость может привести к изменению самого препарата (например, характера и степени гликозилирования) или его выхода и (или) может стать причиной возникновения количественных и качественных различий в профиле примесей.

Именно поэтому обязательны процедуры, обеспечивающие постоянство условий производства, а также характеристик лекарственного препарата; по мере перехода от лабораторной разработки к полномасштабному промышленному производству происходит существенное масштабирование процессов ферментации и (или) очистки, что может значительно повлиять на качество продукта, включая воздействие на его пространственную структуру, выход и (или) количественные и качественные различия в примесях.

В связи с этим в ходе каждого производственного цикла необходимо предусмотреть внутрипроизводственный контроль и испытания по выпускающему контролю качества для подтверждения неизменности свойств получаемого препарата. Настоящая глава применима ко всем препаратам, получаемым с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Для отдельных препаратов могут возникнуть специфичные затруднения при контроле качества, поэтому при производстве и контроле качества каждого препарата следует учитывать все его свойства. 3. Генетическая разработка Генетическая разработка должна соответствовать не только приведенным ниже правилам, но и требованиям, изложенным в главе 5.2 настоящих Правил.

3.1. Целевой ген, вектор и клетка-хозяин

Следует представить подробное описание клонированного гена. Это описание должно включать данные о его происхождении, подлинности и выделении, а также данные о происхождении и структуре экспрессирующего вектора. Необходимо представить описание штамма-хозяина или клеточной линии, включая историю исходного штамма или клеточной линии, их идентификационные признаки и потенциальные вирусные контаминанты. Особое внимание необходимо уделить возможности перекрестной контаминации другими клетками или вирусами.

3.2. Экспрессирующая конструкция

Следует представить подробные сведения о нуклеотидной последовательности целевого гена и фланкирующих контрольных участков экспрессирующего вектора, чтобы подтвердить, что конструкция гена идентична желаемой. Следует подробно описать этапы сборки экспрессирующей конструкции. Следует представить подробную карту и полную аннотированную последовательность функционально значимых участков вектора с указанием участков, секвенированных при создании конструкции, и участков, последовательность которых была определена на основе литературных данных. Последовательность в области точек лигирования фрагментов (непосредственно влияющих на экспрессию введенного гена) в ходе сборки конструкции необходимо подтвердить секвенированием. Необходимо идентифицировать все известные экспрессирующиеся последовательности.

3.3. Состояние рекомбинантной ДНК в клетке хозяина

Следует описать метод, с помощью которого вектор введен в клетку хозяина, и состояние рекомбинантной ДНК в ней (интегрированная или внехромосомная, число копий и т.д.). В отношении внехромосомных экспрессирующих систем необходимо определить процент клеток, сохраняющих экспрессирующую конструкцию.

Последовательность экспрессирующей конструкции, кодирующую рекомбинантный препарат, необходимо проверить на уровне банка клеток. В системах, содержащих множественные интегрированные копии гена, полученные в результате амплификации или без нее, в дополнение к секвенированию молекул мРНК или кДНК следует провести детальное исследование с использованием разных рестрикционных ферментов и Саузерн-блоттинга, чтобы представить убедительные данные о целостности экспрессирующегося гена (генов).

3.4. Экспрессия

Следует детально описать стратегию обеспечения и контроля экспрессии соответствующего гена в ходе производства.

3.5. Стабильность экспрессирующей системы

Стабильность генетических и фенотипических характеристик системы «хозяин-вектор» необходимо исследовать до и после достижения уровня удвоения популяции или числа генераций, используемых при рутинном производстве (клетки предельного для производства клеточного возраста in vitro). Экспрессирующую конструкцию следует анализировать в клетках предельного для производства клеточного возраста in vitro, по меньшей мере, 1 раз для каждого главного банка клеток. По результатам исследований стабильности необходимо также получить подробную информацию о:

  • числе копий гена относительно производительности культуры;
  • делециях и (или) вставках, влияющих на любую часть экспрессирующего вектора;
  • произведенном белке.

Анализ следует выполнять таким образом, чтобы его результаты могли подтвердить то, что число вариантов продукта ниже допустимого предела, устанавливаемого в индивидуальном порядке в зависимости от природы препарата и его предлагаемого применения. Можно провести анализ на уровне белка и (или) ДНК. Какой бы метод ни использовался, он должен пройти валидацию и для него должен быть определен предел обнаружения.

4. Контроль банков клеток

Необходимо следовать требованиям, изложенным в главе 1 настоящих Правил. 5. Ферментация или культивирование клеток Необходимо представить четкое определение серии продукта, который подвергнется дальнейшей обработке. Следует представить подробные данные по ферментации или культивированию клеток с описанием внутрипроизводственного контроля. Необходимо определить критерии отбраковки сбора клеток и преждевременного прекращения культивирования. Наличие, степень и характер любой микробной контаминации в сосудах для культивирования следует внимательно изучить на соответствующей стадии в конце каждого производственного цикла. Необходимо представить подробную информацию для подтверждения достаточной чувствительности методов, используемых для выявления контаминации, и необходимо установить допустимые пределы контаминации.

В идеальном случае одновременно в одной производственной зоне следует культивировать не более одной клеточной линии. При параллельном культивировании других линий клеток следует документировать данные о разных клеточных линиях и представить результаты валидации, подтверждающие отсутствие (невозможность) перекрестной контаминации.

5.1. Производство с однократным сбором

Следует определить максимально допустимое число пассажей или удвоений популяции клеток при производстве. При определении этих показателей необходимо основываться на данных по стабильности системы «клетка-хозяин-вектор» на предельном для производства клеточном возрасте in vitro и превышающим его. Следует представить данные о постоянстве роста культуры и об обеспечении выхода препарата в определенных пределах. В конце производственных циклов следует проводить Процедура контроля за ходом доклинического (неклинического) исследования и обеспечением его проведения, сбора данных и представления результатов исследования согласно протоколу, стандартным операционным процедурам и настоящему стандарту.мониторинг характеристик клетки-хозяина и вектора. Необходимо представить подтверждение того, что вариабельность выхода препарата укладывается в установленные пределы и основные свойства и качество препарата остаются неизменными по ряду специфичных параметров.

5.2. Производство с многократным сбором

Следует определить период непрерывного культивирования, основываясь на данных о стабильности системы и постоянстве качества продукта в рамках этого периода и в течение большего периода времени. На протяжении культивирования требуется мониторинг системы производства. Требуемая частота и тип мониторинга зависят от нескольких факторов, включая тип экспрессирующей системы и препарата, а также общую продолжительность периода непрерывного культивирования.

Приемлемость сборов для последующей обработки должна строго зависеть от использующегося режима мониторинга. Необходимо представить подтверждение того, что выход препарата укладывается в установленные пределы и основные свойства и качество препарата остаются неизменными по ряду специфичных параметров.

6. Очистка продукта

6.1. Методы

Следует подробно описать, обосновать и валидировать методы, используемые для очистки продукта и применяемого внутрипроизводственного контроля, включая заданные в спецификациях допустимые пределы. Использование методик, включающих аффинную хроматографию (например, с использованием моноклональных антител) должно сопровождаться надлежащими мерами, обеспечивающими отсутствие негативного влияния этих веществ и любых других потенциальных контаминантов, образующихся при их использовании, на качество и безопасность лекарственного препарата.

Следует учитывать требования, содержащиеся в главе 10 настоящих Правил и главе 4 настоящих Правил по валидации методов обеспечения вирусной безопасности. Следует тщательно определить критерии повторной переработки всех промежуточных продуктов и готового нерасфасованного продукта, провести валидацию и обосновать их применимость.

6.2. Документированное подтверждение того, что процесс, проводимый в пределах установленных параметров, может осуществляться эффективно и с воспроизводимыми результатами.Валидация процедуры очистки

Следует тщательно проанализировать возможности процесса очистки элиминировать (инактивировать) нежелательные белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, вирусы, происходящие из клеток хозяина, и другие примеси, включая родственные белки.

Следует провести исследование с использованием тщательно отобранной группы вирусов, обладающих широким диапазоном физико- химических свойств, значимых для их поведения в ходе очистки в соответствии требованиями главы 4 настоящих Правил и намеренно привнесенных в неочищенный продукт (spiking).

Следует также подтвердить способность процесса очистки элиминировать (инактивировать) специфичные контаминанты, такие как белки клетки- хозяина, ДНК и другие потенциальные производственные примеси. При необходимости с этой целью можно использовать такие контаминанты в концентрациях, превышающих ожидаемую в ходе нормального производства (spiking).

Следует определить фактор снижения содержания таких контаминантов на каждой стадии очистки и общий фактор снижения их содержания. Валидация процесса очистки должна также включать обоснование рабочих условий, например, емкости колонки, регенерации и санитарной обработки колонок и продолжительности использования колонок. Колонки также следует подвергать валидации в отношении вымывания лигандов (например, красителя, аффинного лиганда и др.) и (или) хроматографического субстрата в течение ожидаемого срока службы колонки.

7. Активная фармацевтическая субстанция

7.1. Установление характеристик активной фармацевтической субстанции

7.1.1. Физико-химическая характеристика, относительная молекулярная масса, изоэлектрическая точка

Необходимо тщательно установить характеристики активной фармацевтической субстанции с помощью физико-химических и биологических методов. Особое внимание следует уделить использованию широкого диапазона аналитических методик, оценивающих разные физико-химические свойства молекулы; например, размер, заряд, изоэлектрическую точку и гидрофобность. Перечень аналитических возможностей не входит в настоящую главу. Далее представлены отдельные требования к разновидностям анализа.

7.1.2. Подтверждение структуры активной фармацевтической субстанции (включая сравнение с стандартным материалом или природным продуктом)

Следует представить данные об аминокислотной последовательности продукта гена в объеме, достаточном для его адекватной характеристики. Необходимая степень подробности описания генетической последовательности зависит от размера и сложности молекулы, а также от использования других испытаний для установления характеристик. Во многих случаях для оценки последовательности возможно использование разделения с помощью ВЭЖХ с последующим секвенированием пептидов, полученных с помощью ферментативного расщепления. Следует обратить внимание на возможное наличие N-концевого метионина и N-формилметионина, сигнальных или лидерных последовательностей, других возможных N 150 и C-концевых модификаций (протеолитический процессинг). Следует рассмотреть возможность использования современных методов масс-спектрометрии при характеристике первичной структуры.

7.1.3. Посттрансляционные модификации

Помимо протеолитического процессинга потенциальными типами посттрансляционных модификаций являются N и О-гликозилирование и, например, ацетилирование, гидроксилирование и γ-карбоксилирование. Кроме того, существуют посттрансляционные модификации, возникающие в результате процессов расщепления, например, дезаминирования и окисления. Некоторые препараты рекомбинантных ДНК являются гликопротеинами. Существует огромное множество олигосахаридных структур, которые характеризуются гетерогенностью гликоформ как в их естественной форме, так и образующихся по технологии рекомбинантных ДНК. На характер этой гетерогенности могут влиять многие факторы. Профиль гликозилирования молекулы может играть важную роль при определении ее активности особенно in vivo. Объем проводимого анализа должен определяться ролью, которую играют углеводные группы, если эти данные известны. Следует рассмотреть весь диапазон разных аналитических методик (например, количественное изоэлектрическое фокусирование или капиллярный электрофорез, анионообменная хроматография для анализа моносахаридного компонента и определения олигосахаридов, лектин- аффинная хроматография и масс-спектрометрия).

7.1.4. Данные о конформации макромолекул

Рекомендуется применять соответствующие испытания, позволяющие установить то, что продукт имеет желаемую конформационную структуру и степень агрегированности. Примерами подходящих для таких целей методов являются электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фокусирование, высокоэффективная жидкостная хроматография (эксклюзионная, обращенно-фазовая, ионообменная, аффинная), пептидное картирование с последующим секвенированием, светорассеяние, ультрафиолетовая спектроскопия, круговой дихроизм и масс-спектроскопия. Значимая информация получается при проведении дополнительных исследований продукта, используя, например, ядерно-магнитную резонансную спектроскопию, рентгеновскую кристаллографию и соответствующие иммунохимические методы.

7.1.5. Установление биологических и иммунологических характеристик молекул, способ выражения дозировки продукта

Для биологической и иммунологической характеристики следует использовать как можно более широкий набор методов. Необходимо определить удельную активность высокоочищенного материала (единицы активности на массу продукта). По возможности биологическую активность продукта и его физические характеристики, включая аминокислотную последовательность, следует сравнивать с аналогичными показателями высокоочищенного продукта природного происхождения.

7.2. Чистота

Необходимо представить данные о контаминантах, наличие которых ожидается в готовом обработанном продукте. Необходимо обосновать допустимую степень контаминации и представить критерии приемлемости или отбраковки промышленной серии. Важно оценивать чистоту препарата с использованием как можно более широкого диапазона методик, включая физико-химические и иммунологические. Необходимо провести испытания на наличие нежелательных материалов, проистекающих от клеток хозяина, а также материалов, которые могли быть использованы (добавлены) в процессе производства или очистки, и, если применимо, контаминации вирусами и нуклеиновыми кислотами.

8. Постоянство характеристик и посерийный контроль готовой нерасфасованной (балк) фармацевтической субстанции

В целях установления постоянства характеристик подлинности, чистоты и активности необходимо провести всесторонний анализ начальных серий продукта. Впоследствии можно будет ограничиться сокращенным набором испытаний, который представлен ниже. Следует четко различать аналитические испытания, проводимые в ходе разработки препарата с целью полного установления характеристик фармацевтической субстанции, и испытания, рутинно выполняемые с каждой серией очищенного нерасфасованного продукта.

8.1. Постоянство характеристик Число последовательных серий нерасфасованного обработанного продукта, подвергшихся анализу, должно составлять не менее 5 серий (при достаточном обосновании допустимо меньшее число серий). Их следует охарактеризовать настолько полно, насколько это возможно, чтобы подтвердить постоянство состава. При производстве с многократным сбором продукта, как правило, следует исследовать серии продукта из разных циклов культивирования. Следует использовать биологические, физико-химические и иммунологические методы для характеристики и анализа активной фармацевтической субстанции (включая методы, подтверждающие постоянство профиля гликозилирования гликопротеинов) и методы выявления и идентификации примесей. Все выявленные различия между сериями необходимо документировать.

8.2. Посерийный контроль качества

8.2.1. Подлинность

Для подтверждения подлинности каждой серии препарата необходимо выбрать часть испытаний, использованных для характеристики очищенной активной фармацевтической субстанции в соответствии с указания раздела 7.1 настоящей главы. Используемые методы должны включать испытания физико-химических и иммунологических свойств вместе с испытанием на ожидаемую биологическую активность. В зависимости от масштабов других испытаний на подлинность следует проводить верификацию N- или С-концевой аминокислотной последовательности или использовать другие методы, например, пептидное картирование.

8.2.2. Чистота

Степень желаемой и достижимой чистоты будет зависеть от нескольких факторов: природы и целевого назначения продукта, метода его производства и очистки, а также от степени постоянства характеристик производственного процесса. Используя современные технологические процессы, можно добиться очень высокой степени чистоты большинства препаратов. Следует определять чистоту продукта в каждой серии, она должна оставаться в заданных пределах.

Анализ должен включать чувствительные и надежные методы исследования ДНК клетки-хозяина и (или) вектора, которым необходимо подвергать каждую серию продукта, приготовленного из линий клеток млекопитающих, при этом необходимо установить верхнее предельное содержание ДНК.

Рекомендуется также проводить испытания каждой серии нерасфасованного продукта, полученного из других эукариотических клеточных систем, на содержание ДНК и установить предельное содержание ДНК. В прокариотических экспрессирующих системах следует проводить испытания на ДНК, если это необходимо для обеспечения качества препарата. Также необходимо с помощью достаточно чувствительного метода количественного определения определять остаточные клеточные белки путем проведения анализа с соответствующей чувствительностью (например, parts per million (ppm), частей на миллион) и установить строгое верхнее предельное их содержание. В некоторых случаях потенциальные примеси, например ДНК, могут быть выявлены в промежуточных продуктах очистки на более раннем этапе.

8.2.3. Испытание на активность

Следует определить активность каждой серии препарата (например, в единицах биологической активности на миллилитр), по возможности используя соответствующий национальный или международный стандартный препарат, калиброванный в единицах биологической активности как это указано в разделе 9 настоящей главы. Следует оценить удельную активность препарата (единицы биологической активности на единицу массы препарата). Оцененную удельную активность необходимо документировать. Для стандартизации определения удельной активности необходимо использовать высокоочищенный стандартный препарат в соответствии с разделом 9 настоящей главы.

Рекомендуется оценить корреляцию между результатами определения активности биологическими методами и физико-химическими методами анализа и представить полученные данные. По возможности серии следует стандартизовать, используя точные физико-химические методики, а биологический анализ следует применять для подтверждения биологической активности препарата «в указанных пределах».

9. Спецификация и стандартные материалы

Исследования, указанные в разделе 7 настоящей главы, позволяют подготовить окончательную спецификацию на препарат, если они подтверждаются данными, полученными при исследованиях последовательных серий, и данными посерийного контроля в соответствии с разделом 8 настоящей главы. Правильно подобранную серию препарата, предпочтительно изученную клинически, следует полностью охарактеризовать с точки зрения ее химического состава, чистоты, активности и биологической активности, включая по возможности полное аминокислотное секвенирование. Исследованную таким образом серию препарата рекомендуется сохранить для использования в качестве химического и биологического стандартного материала. Следует установить критерии продолжительности использования (срока годности) и (или) возможного повторного испытания и квалификации стандартных образцов.

10. Лекарственный препарат и фармацевтическая разработка

Разработку лекарственного препарата необходимо подробно описать и обосновать, уделив особое внимание описанию наличия и содержания стабилизатора (например, альбумина и (или) детергентов). Необходимо подтвердить, что лекарственный препарат в окончательных контейнерах соответствует требованиям фармакопеи Союза, утверждаемой Комиссией, и актов в сфере обращения лекарственных средств, входящих в право Союза. При невозможности выполнения испытаний производитель должен обосновать их исключение.

Определения

Для целей настоящей главы используются понятия (термины), которые означают следующее:

  • «готовая нерасфасованная фармацевтическая субстанция» – получаемый из нерасфасованного сбора по завершении процесса производства готовый продукт, который хранится в одном контейнере или при необходимости в нескольких одинаковых контейнерах и используется при производстве готовой лекарственной формы. Производство серии готового продукта должно быть четко описано и подробно документировано производителем;
  • «лекарственный препарат» – активная фармацевтическая субстанция в составе лекарственной формы, расфасованной в первичную упаковку (укупоренные контейнеры) для ее сохранности, которая является лекарственным препаратом. Контейнеры, составляющие одну серию фасовки, должны обрабатываться в рамках  одного производственного цикла, их содержимое и биологическая активность должны быть однородны;
  • «нерасфасованный сбор» – однородный пул отдельных сборов или лизатов, обрабатываемый в ходе одного цикла очистки.