Наши услуги
О нас
Доклинические исследования
Регламент
Видео доклинические исследования
Клинические исследования
Регламент
Клинические исследования видео
Набор добровольцев
Архив исследований
Набор пациентов
Новости медицины
Интервью
Архив новостей
Контакты
Вакансии
НАВЕРХ

Регламент

Приложение № 1 к главе 11 Правил проведения исследований биологических лекарственных средств Евразийского экономического союза

Требования к характеристике методов и оценке иммуногенности

I. Разновидности количественного определения антител

1. Методы скрининга

Необходимость скрининга относительно большого количества образцов требует использования высокопроизводительных аналитических методик с высокой степенью автоматизации. К этим методам относятся иммунологические методы, а также радиоиммунопреципитация и поверхностный плазмонный резонанс. Все они направлены на выявление взаимодействия между антигенами и антителами (связывание), но основаны на разных научных (технических) принципах. Иммунологические виды анализа представляют большую группу методик и основаны на разнообразных способах и системах обнаружения. К ним относятся аналитические методики, выявляющие прямое связывание, связующие методики, методики захвата (сэндвич- анализ) и конкурентные иммунологические анализы, основанные на радиолигандных, ферментных, флюоресцентных, хемилюминесцентных и электрохимических люминесцентных системах обнаружения.

2. Методы, подтверждающие наличие антител

Для этих целей можно использовать различные аналитические методики, ввиду меньшего по сравнению с методами скрининга, количества образцов, подлежащих анализу, здесь высокая производительность играет меньшую роль. В целях подтверждения специфичности, необходимо включать методики, позволяющие ее оценить. Например, добавление избыточного количества антигена в образец до начала работы с методиками связывания, приводит к абсорбции антител и, как следствие, снижению частоты положительных сигналов от истинно серопозитивных образцов. Выявление в качестве анализируемого вещества иммуноглобулинов в некоторых аналитических методиках, например, путем использования антииммуноглобулиновых реактивов, может помочь в обнаружении доподлинно серопозитивных образцов. В некоторых сложных случаях рекомендуется использовать аналитические методики, основанные на иных научных (технических) принципах, чем используемые в методах скрининга. Кроме того, следует учитывать различие характеристик используемых методик, например, их различную чувствительность.

3. Методы градации специфичности антител

Для дифференцирования специфичности выявленных антител используют аналитические иммунологические методы, такие как иммуноблоттинг и радиоиммунопреципитация.

4. Методы определения нейтрализующей активности

В зависимости от свойств лекарственного препарата для определения нейтрализующей активности антител могут быть использованы биологические методы количественного определения, включая функциональные. Обычно для анализа выбирают определенную концентрацию биологического лекарственного препарата, а его разведения используют для оценки ингибирующего действия при снижении концентрации антител. Это позволяет определить нейтрализующую дозу и рассчитать нейтрализующую способность (титр) антител для каждого образца.

5. Методы оценки клеточного иммунного ответа

Стратегия оценки клеточного иммунного ответа, обусловленного биологическим лекарственным препаратом, как правило, сложнее по сравнению с оценкой гуморального ответа. Если такие испытания необходимы, требуются их специальная разработка и выбор метода для каждого конкретного случая индивидуально. В большинстве случаев развитие эффективного ответа с участием IgG обусловлено участием антигенспецифичных Т-хелперов. Примерами методов количественного определения, используемых для обнаружения (оценки) клеточного иммунного ответа, являются методы определения стимуляции (пролиферации) Т-клеток, а также методы оценки выработки (высвобождения) цитокинов (например, IL-2, IL-4, ИФН-гамма). Это предполагает использование Т-клеток, иногда совместного культивирования Т-клеток с клетками других популяций, например, дендритными клетками. Для этих целей обычно используют метод иммуноферментных пятен (Elispot) и проточную цитометрию.

В некоторых случаях используют анализ клеточно-опосредованной цитотоксичности. Иногда необходимо использовать более детальные исследования, включающие оценку клеточного иммунного ответа. Изучение B-клеток памяти (некоторых случаях T-клеток памяти) может дать полезную информацию о природе иммунного ответа, результаты исследования также могут иметь прогностическую ценность в отношении потенциальной иммуногенности исследуемого лекарственного препарата.

С этой целью могут быть проведены исследования с использованием пептидов или белков (в зависимости от вида анализа и его целей), и использован метод иммуноферментных пятен. В других случаях могут быть полезны более сложные исследования клеточного иммунитета, например, изучение регуляторных T-клеток. В зависимости от целей и задач, необходимость в таких исследованиях должна рассматриваться индивидуально.

II. Характеристики аналитических методов

Выбор, оптимизацию и анализ результатов испытаний следует выполнять в соответствии с поставленными задачами. Важность и требования к характеристикам методов (перечень некоторых из них приведен выше в подразделе «Методы скрининга») зависят от используемой методики. Например, может отсутствовать необходимость в высокой чувствительности метода, если его не используют для определения содержания антител, выработанных в ответ на лечение определенным биологическим лекарственным препаратом.

Нецелесообразно разрабатывать и использовать высокочувствительные методы для определения таких антител, особенно если чувствительность метода достигается в ущерб другим важным характеристикам, например, специфичности, устойчивости. Выбор самого простого метода, удовлетворяющего всем требованиям, является разумным подходом, особенно при высокой значимости большой производительности, например при скрининге. Тем не менее следует внимательно следить за тем, чтобы это отрицательно не сказывалось на других этапах оценки иммуногенности. Например, прямой иммуноферментный анализ (ИФА) с антигеном, иммобилизованным на поверхности лунок планшета, представляет простейший вид испытания, но характеризуется большим количеством ложноположительных результатов.

Кроме того, для этих методов характерна высокая частота ложноотрицательных результатов при использовании образцов, содержащих низкоаффинные антитела или определенные их изотипы или подклассы. Во избежание вышеуказанных проблем необходимо выбрать более подходящий вид анализа, например «связующие» методы, электрохемилюминесценцию или поверхностный плазмонный резонанс. Могут встречаться ложноотрицательные результаты скринингового метода, обусловленные маскировкой эпитопов. Во избежание этого следует придерживаться соответствующей стратегии, например, использовать методы, при выполнении которых специфическая маскировка определенных эпитопов невозможна.

III. Стандартизация, стандартные материалы, хорошо охарактеризованные контроли и Документированное подтверждение того, что процесс, проводимый в пределах установленных параметров, может осуществляться эффективно и с воспроизводимыми результатами.валидация методик

Для всех видов методик необходимы серопозитивные стандартные образцы (материалы, контроли). Они используются для подтверждения отклика методики и ее калибровки (градуировки). По возможности, они должны являться препаратами крови человека с высоким содержанием антител, полученными в достаточном количестве для продолжительного использования. Их свойства должны быть хорошо охарактеризованы; хранение таких материалов осуществляется в надлежащих условиях (в виде лиофилизата или замороженными при подходящих температурах).

Стандартные препараты для биологических методов количественного определения, направленных на определение нейтрализующей активности, должны обладать высокой нейтрализующей способностью, однако для проведения валидации, необходимо располагать препаратами антител, не обладающими нейтрализующей активностью. В ряде случаев для приготовления необходимых стандартных препаратов в наличии может оказаться не достаточное количество плазмы человека. В этой ситуации наилучшим подходом, который позволяет избежать проблем в силу особенностей определенного донора, является объединение образцов.

Иногда объема человеческой плазмы не только не хватает для объединения, она может вообще отсутствовать, например, на ранней стадии разработки, в таких случаях единственно возможным решением является использование плазмы животных. При этом требуется тщательный выбор вида животных, а применение такой плазмы носит ограниченный характер по сравнению со стандартными препаратами, полученными из крови человека. Например, иммунохимические анализы, включающие использование антител к человеческим иммуноглобулинам, могут давать ложные результаты при инкубации с нечеловеческими антителами, а результаты любых исследований могут отличаться от результатов, полученных при изучении антител человека, содержащихся в человеческой плазме.

В силу гетерогенности структуры, специфичности и авидности иммуноглобулинов, содержащихся в стандартах образцах и пробах, Совокупность операций, устанавливающих соотношение между значением величины, полученной используемым прибором и соответствующим значением величины, определяемой с помощью эталона.калибровка (градуировка) иммунологических методов анализа является трудной задачей. Это обуславливает сложность и невозможность прямого правильного сравнения испытуемых образцов и стандартных материалов, особенно по их массе. Вследствие чего калибровку таких методов анализа необходимо осуществлять, используя хорошо описанные приемлемые обоснованные подходы.

Одним из способов может служить представление результатов иммунологических методов анализа в виде титра, основанное на стандартных процедурах вычисления его значения. Другим способом является вычисление относительной концентрации антител в испытуемых образцах и положительных контролях. Биологические методы анализа, используемые для оценки нейтрализующей способности антител, необходимо калибровать с помощью международных стандартных образцов (стандартных препаратов) (при наличии). Это позволяет выразить нейтрализующую активность в понятных единицах биологической активности лекарственного препарата (препарата крови) и получить необходимую информацию для валидации аналитических методик.

При недоступности указанных стандартов необходимо разработать собственные препараты. Во многих случаях рекомендуется выражать нейтрализующую способность образцов по их объему, необходимому для нейтрализации постоянной биологической активности препарата, например, в миллилитрах плазмы или заранее заданных единицах биологической активности биологического препарата. В иных случаях допускается использовать разведение образцов (титр), необходимое для нейтрализации биологической активности препарата.

Также настоятельно рекомендуется располагать набором стандартных материалов, содержащих различные количества антител, и набором антител с различными свойствами, которые можно использовать для установления характеристик и валидации аналитических методик и которые могут служить показателями их функциональности. По возможности они должны включать 1 или более препаратов с низким содержанием антител (близким к нижнему пределу обнаружения) и препаратов антител с низкой авидностью. В целях определения исходных параметров аналитической методики, установления характеристик и валидации необходимы негативные стандартные образцы и их контроли.

Исходные параметры аналитической методики у здоровых субъектов можно с легкостью определить путем определения ее результатов при анализе образцов, полученных от достаточного числа таких субъектов и их анализа с целью получения статистически надежных исходных значений. Однако этот способ может не позволить охарактеризовать исходные параметры аналитической методики при анализе образцов, полученных от пациентов, поэтому такие параметры придется определять отдельно, используя образцы от пациентов, полученных до начала лечения, или образцы, полученные от других подходящих субъектов. Как бы то ни было, в образцах некоторых субъектов (пациентов) могут содержаться антитела, выработанные еще до начала лечения, или другие вещества, которые могут давать значительные ложноположительные результаты, поэтому в целях обеспечения правильной интерпретации результатов, полученных после начала лечения, необходим скрининг пациентов. Необходимо установить требования и подобрать приемлемые спецификации для используемых в анализах реактивов, по меньшей мере важнейших.

IV. Интерпретация результатов

Необходимо установить четкие критерии разделения образцов на серопозитивные и серонегативные, а также критерии подтверждения положительного результата. Подходы к решению этой задачи могут быть разными в зависимости от метода и других факторов, что требует должного обоснования. Общим способом определения порога принятия результата как положительного при выполнении иммунологических методов является установление исходных параметров. Для определения значения такого порога рекомендуется использовать статистические методы. С другой стороны, допускается использование реальных данных (например, удвоенное значение, установленное при изучении исходных параметров) в качестве минимального положительного значения.